間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類(lèi)能夠從骨髓、脂肪、羊膜和牙髓等多種組織分離的干細(xì)胞。由于其具有多向分化潛能，不表達(dá)人白細(xì)胞抗原DR位點(diǎn)(Human leukocyte antigen-antigenD related，HLA-DR)、CD45等細(xì)胞表面標(biāo)志的低免疫原性，以及向損傷組織、腫瘤部位歸巢和促進(jìn)組織再生的特性，以MSCs為主的干細(xì)胞治療有望成為腫瘤和一些自體免疫疾病的新型治療手段

2、。目前已證明MSCs在體內(nèi)外能夠分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。其中，NF-κB信號(hào)通路也參與了該過(guò)程，然而完整的抑制機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道。起源于皮膚、黏膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的黑色素瘤中有50％的病例與BRAF基因突變有關(guān)。該基因突變的發(fā)生導(dǎo)致白介素-1(Interleukin-1，IL-1)持續(xù)激活NF-κB信號(hào)通路，使得黑色素瘤細(xì)胞細(xì)胞周期失控，進(jìn)而導(dǎo)致了腫瘤的形成和發(fā)展。有研究證明MSC

3、s能夠分泌IL-1的受體拮抗劑(Interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra)，而IL-1Ra可以特異性地抑制IL-1激活NF-κB信號(hào)通路。由此推斷，MSCs可能通過(guò)此路徑抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖。鑒于此，本論文將MSCs、IL-1Ra、NF-κB和黑色素瘤結(jié)合起來(lái)，探究MSCs對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用及其基于NF-κB的抑制機(jī)制，為腫瘤的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，拓展干細(xì)胞的應(yīng)用范圍。
　　方法:

4、首先，利用transwell進(jìn)行MSCs與黑色素瘤A375細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)MSCs是否對(duì)A375細(xì)胞有抑制作用。其次，利用條件培養(yǎng)基(Conditioned medium,CM)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)在無(wú)腫瘤的刺激和接觸下，MSCs通過(guò)分泌細(xì)胞因子對(duì)A375細(xì)胞增殖產(chǎn)生的抑制作用。隨后對(duì)MSCs CM培養(yǎng)的A375細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀檢測(cè)，探究MSCs是抑制A375細(xì)胞增殖還是促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡作用。WesternBlot檢測(cè)了CM實(shí)

5、驗(yàn)中A375細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。然后根據(jù)GeneBank上IL-1Ra的序列設(shè)計(jì)引物，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)驗(yàn)證IL-1Ra在MSCs中的表達(dá)，同時(shí)利用得到的IL-1Ra片段構(gòu)建了IL-1Ra的過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-EGFP-IL-1Ra和沉默載體pGPH1-IL-1Ra，轉(zhuǎn)染入MSCs，并利用We

6、stern Blot實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了正常MSCs、過(guò)表達(dá)IL-1Ra的MSCs（MSCs-O）和沉默了IL-1Ra表達(dá)的MSCs(MSCsS)中IL-1Ra的表達(dá)水平。隨后，獲取MSCs-O和MSCs-S的CM，利用不同濃度的CM進(jìn)行條件培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)，觀察過(guò)表達(dá)或沉默IL-1Ra后對(duì)A375細(xì)胞增殖的抑制情況。同時(shí)對(duì)CM培養(yǎng)的A375細(xì)胞再次進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測(cè)。然后探究了MSCsS和MSCs-O的CM培養(yǎng)的A375細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)

7、蛋白表達(dá)情況。最后進(jìn)行了裸鼠異位瘤實(shí)驗(yàn)，分別共注射MSCs或MSCs-S或MSCs-O和A375細(xì)胞，觀察腫瘤形成情況，測(cè)量腫瘤體積，并進(jìn)行蘇木精-伊紅組織切片染色(Hematoxylin-eosin staining，H&E)。
　　結(jié)果:transwell共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，MSCs在非直接接觸的條件下對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞增殖具有抑制作用，在MSCs與A375細(xì)胞比例為5∶1培養(yǎng)72h時(shí)抑制率最高，達(dá)到38.93％，且隨著處

8、理時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率也隨之增加(p＜0.001)。CM實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，MSCs通過(guò)分泌可溶性細(xì)胞因子抑制A375細(xì)胞而不必與腫瘤細(xì)胞直接接觸刺激;100％的MSCs CM對(duì)A375細(xì)胞培養(yǎng)72 h，抑制率最高，達(dá)到26.50％，但抑制率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)并無(wú)明顯變化。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)證明，MSCs引起A375細(xì)胞的G1期阻滯，造成A375細(xì)胞增殖受到抑制，當(dāng)處理時(shí)間為72 h時(shí)，80％ MSCs CM組的G1期細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組G1期細(xì)胞數(shù)相比差異

9、極顯著(p＜0.001);而Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該抑制作用的發(fā)生與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。利用IL-1Ra片段構(gòu)建瞬時(shí)過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-EGFP-IL-1Ra和沉默載體pGPH1-IL-1Ra轉(zhuǎn)染入MSCs得到的MSCs-O和MSCs-S能夠有效地提高和抑制IL-1 Ra的表達(dá)水平。MSCs-S的CM實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與MSCs的CM實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，IL-1Ra表達(dá)受到沉默后，MSCs-S對(duì)A375

10、細(xì)胞的抑制作用降低，抑制率也降低到14.25％; IL-1Ra過(guò)表達(dá)后，MSCs-O對(duì)A375細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，且最高抑制率也提高到31.49％。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明與MSCs的CM組相比MSCs-O提高了A375細(xì)胞在G1期的細(xì)胞數(shù)(p＜0.05);而與MSCs的CM組相比，在處理72h后，MSCs-S明顯減少了A375細(xì)胞在G1期的細(xì)胞數(shù)(p＜0.01)。NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)蛋白p65和TRAF6表達(dá)也隨著IL-1Ra的表達(dá)水

11、平提高而降低，當(dāng)IL-1Ra表達(dá)被沉默后p65與TRAF6表達(dá)水平則提高。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，IL-1Ra的表達(dá)水平影響腫瘤的形成和大小，分別共注射MSCs、MSCs-S、MSCs-O和A375細(xì)胞28d后，MSCs-O組與MSCs-S組、MSCs組和A375組相比腫瘤體積差異極顯著(p＜0.001); H&E染色結(jié)果證明，MSCs、MSCs-O和MSCs-S與其他對(duì)照組相比纖維樣組織更多，且腫瘤包膜更明顯。
　　結(jié)論:本研究通過(guò)體內(nèi)外