靈芝多糖拮抗黑色素瘤細(xì)胞上清對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能抑制作用的研究.pdf

1、目的:
　　 黑色素瘤(Melanoma)是一種起源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤,因其惡性程度高,預(yù)后差而對(duì)人類健康構(gòu)成極大威脅。本病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與機(jī)體的免疫系統(tǒng)關(guān)系密切。巨噬細(xì)胞是機(jī)體天然免疫的重要執(zhí)行者之一,在抗腫瘤免疫中既是抗原提呈細(xì)胞,也是殺傷腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞。其殺傷機(jī)制除了與腫瘤細(xì)胞結(jié)合,通過釋放溶酶體酶直接殺傷腫瘤細(xì)胞外,還可以處理和提呈腫瘤抗原、分泌細(xì)胞因子等間接殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞也可以通過多種方式逃避機(jī)體免疫系

2、統(tǒng)的攻擊,抑制機(jī)體免疫功能的發(fā)揮,其分泌的多種免疫抑制分子對(duì)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、LAK細(xì)胞及NK細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞均有抑制作用。靈芝多糖(Ganoderma lucidumPolysaccharides,Gl-PS)是植物靈芝的主要活性成分之一。靈芝多糖可以活化巨噬細(xì)胞,增加巨噬細(xì)胞一氧化氮(NO)、TNF-α的分泌。但靈芝多糖能否拮抗腫瘤細(xì)胞上清對(duì)巨噬細(xì)胞的抑制作用,尚無專題實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因此,本實(shí)驗(yàn)研究B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液

3、對(duì)同基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫功能的抑制作用,以及靈芝多糖拮抗黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)同基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的抑制作用,探討其機(jī)制,為腫瘤的免疫治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞來源:本實(shí)驗(yàn)采用的B16F10黑色素瘤細(xì)胞是一種來源于C57BL／6j小鼠的高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系；腹腔巨噬細(xì)胞為新鮮制備的C57BL／6j小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞；L929細(xì)胞是來源于小鼠的成纖維細(xì)胞。
　　 2.制備B16F10

4、黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清:2×105／ml B16F10黑色素瘤細(xì)胞,接種于50ml培養(yǎng)瓶,每瓶10ml細(xì)胞懸液,培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80％時(shí)換液,繼續(xù)培養(yǎng)8h,收集培養(yǎng)上清,0.22μm濾紙濾菌,分裝,-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　 3.實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù):分為B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組,B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清加不同濃度靈芝多糖組(0.2μg／ml、0.8μg／ml、3.2μg／ml、12.8μg／ml),RPMI-1640

5、培養(yǎng)基對(duì)照組。各組均含有相同濃度的細(xì)菌脂多糖LPS10μg／ml。
　　 4.采用噻唑藍(lán)比色(MTT)方法,檢測(cè)靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞的抑制作用。
　　 5.采用中性紅吞噬實(shí)驗(yàn),檢測(cè)靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的抑制作用。
　　 6.采用Griess方法檢測(cè)NO的含量,檢測(cè)靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)巨噬細(xì)胞釋放

6、NO的抑制作用。
　　 7.采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法,觀察靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的抑制作用。
　　 8.采用噻唑藍(lán)比色(MTT)方法,通過L929細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn),檢測(cè)靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF-α活性的抑制作用。
　　 9.采用蛋白印跡(Western-blot)技術(shù),檢測(cè)靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)腹腔巨

7、噬細(xì)胞細(xì)胞釋放TNF-α的抑制作用。
　　 10.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,p<0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)LPS誘導(dǎo)的同基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的抑制作用:未加靈芝多糖的B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組腹腔巨噬細(xì)胞活性、吞噬中性紅的能力、釋放NO水平分別為0.411±0.035、0.596±0.100、4.

8、830±1.384,與對(duì)照組的0.861±0.208、1.275±0.102、11.455±0.175相比,均明顯降低,經(jīng)方差分析,各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；Western-blot及L929細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)及活性分別為3.221±0.333和0.387±0.030,與對(duì)照組的0.84±0.213和0.746±0.049相比,TNF-α的表達(dá)均明顯降低,經(jīng)方差分析,各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<

9、0.05)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組TNF-α的表達(dá)明顯降低于RPMI-1640培養(yǎng)基對(duì)照組。
　　 2.靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞的抑制作用:MTT結(jié)果顯示,在不同濃度靈芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作用的LPS誘導(dǎo)24h后的同基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞OD值分別為0.439±0.041、0.492±0.037、0.679±0.051、0.81

10、8±0.123,結(jié)果明顯高于未用靈芝多糖作用的B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組0.411±0.035,呈一定的劑量依賴關(guān)系,但均未能達(dá)到RPMI-1640培養(yǎng)液對(duì)照組0.861±0.208。經(jīng)方差分析,差異有顯著性(F=21.339,p<0.05)。兩兩比較除B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組與0.2μg／ml組、0.8μg／ml組；0.2μg／ml組與0.8μg／ml組；3.2μg／ml組與12.8μg／ml組、RPMI-1640培

11、養(yǎng)液對(duì)照組；12.8μg／ml組與RPMI-1640培養(yǎng)液對(duì)照組之間比較差異無顯著性外,各組之間差異均有顯著性(p<0.05)。
　　 3.靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的抑制作用:在不同濃度靈芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作用的LPS誘導(dǎo)24h后的同基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的OD值分別為0.686±0.056、0.765±0.037、0.778±0.046

12、、0.787±0.057,結(jié)果明顯高于未用靈芝多糖作用的B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組0.596±0.100,呈一定的劑量依賴關(guān)系,但均未能達(dá)到RPMI-1640培養(yǎng)液對(duì)照組1.275±0.102。經(jīng)方差分析,差異有顯著性(F=67.054,p<0.05)。兩兩比較除B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組與0.2μg／ml組；0.2μg／ml組與0.8μg／ml組、3.2μg／ml組、12.8μg／ml組；0.8μg／ml組與3.2μg

13、／ml組、12.8μg／ml組；3.2μg／ml組與12.8μg／ml組之間比較差異無顯著性外,各組之間差異均有顯著性(p<0.05)。
　　 4.靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制作用:在不同濃度靈芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作用的LPS誘導(dǎo)24h后的同基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放。NO值分別為5.749±1.109、5.717±1.131、6.081±1.597

14、、8.060±1.375,結(jié)果明顯高于未用靈芝多糖作用的B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組4.830±1.384,但均未能達(dá)到RPMI-1640培養(yǎng)液對(duì)照組11.455±0.175。經(jīng)方差分析,差異有顯著性(F=12.032,p<0.05)。兩兩比較B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組和各不同濃度靈芝多糖組之間差異無顯著性,與RPMI-1640培養(yǎng)液對(duì)照組之間差異均有顯著性(p<0.05)。
　　 5.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)靈芝多糖

15、拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的抑制作用:在不同濃度靈芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)LPS誘導(dǎo)24h后的同基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的抑制作用明顯減低,巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)增加,免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性程度明顯高于未經(jīng)靈芝多糖作用的B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組,但均低于RPMI-1640培養(yǎng)液對(duì)照組。
　　 6.L929細(xì)胞增殖情況檢測(cè)靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞

16、培養(yǎng)上清對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的抑制作用:經(jīng)含有不同濃度靈芝多糖的B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作用同基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞24h后的培養(yǎng)上清作用L929,48h后L929細(xì)胞OD值分別為0.600±0.032、0.599±0.084、0.550±0.076、0.496±0.045,結(jié)果明顯低于未用靈芝多糖作用的B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組0.746±0.049,呈一定的劑量依賴關(guān)系,但均未能達(dá)到RPMI-1640培

17、養(yǎng)液培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞上清培養(yǎng)組0.387±0.030,各組結(jié)果均明顯低于RPMI-1640培養(yǎng)液對(duì)照組0.897±0.038。經(jīng)方差分析,差異有顯著性(F=57.145,p<0.05)。兩兩比較除0.2μg／ml組與0.8μg／ml組、3.2μg／ml組；0.8μg／ml組與3.2μg／ml組；3.2μg／ml組與12.8μg／ml組之間比較差異無顯著性外,各組之間差異均有顯著性(p<0.05)。
　　 7.Western-blo

18、t方法檢測(cè)靈芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的抑制作用:在不同濃度靈芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)LPS誘導(dǎo)24h后的同基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)的抑制作用明顯減低,相對(duì)表達(dá)量分別為1.068±0.243、1.367±0.138、1.753±0.083、2.006±0.323,明顯高于未用靈芝多糖作用的B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清組0.84±0.21,且呈劑量依

19、賴關(guān)系,但均低于RPMI-1640培養(yǎng)液對(duì)照組3.221±0.333。經(jīng)方差分析,差異有顯著性(F=38.296,p<0.05)。兩兩比較除B16F10黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清與0.2μg／ml組；0.2μg／ml組與0.8μg／ml組；0.8μg／ml組與3.2μg／ml組；3.2μg／ml組與12.8μg／ml組之間比較差異無顯著性外,各組之間差異均有顯著性(p<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.B16F10黑色素瘤