TNF-α誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞衰老作用機制研究.pdf

1、目的：
　　腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor, TNF-α)是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞發(fā)生自體吞噬，但是其是否能夠誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16和B16 F10細(xì)胞發(fā)生衰老目前尚不清楚。因此，本研究旨在探討TNF-α是否能夠誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生衰老及其誘

2、導(dǎo)細(xì)胞衰老的作用機制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16和B16F10細(xì)胞，根據(jù)處理方法的不同分為3組:對照組、TNF-α處理組（20ng/ml TNF-α處理12h、24h、48h）、3-MA+TNF-α處理組（10mmol/L3-MA預(yù)處理2h，20ng/ml TNF-α處理12h、24h、48h）。
　　2.相差顯微鏡觀察油紅O染色后TNF-α處理不同時間點B16細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量的變化。
　　3

3、.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測TNF-α處理不同時間點B16和B16 F10細(xì)胞周期G1/G0期百分比的變化。
　　4.收取不同處理組的B16和B16 F10細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測衰老相關(guān)基因p16、p21、p53、CDK2、CDK4、CyclinD、CyclinE、Rb、E2F-1mRNA的表達(dá)變化。
　　5.收取不同處理組的B16細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白免疫印跡(Wes

4、tern blot)方法檢測細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p53、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因Rb磷酸化水平的變化、細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F-1和Ras-Raf-MAPK信號通路上關(guān)鍵蛋白K-Ras、磷酸化Erk、NF-κB的表達(dá)變化。以及自噬標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、自噬性死亡標(biāo)志蛋白Beclin1在B16 F10細(xì)胞中的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比，TNF-α處理24h后B16細(xì)胞內(nèi)有少量脂滴出現(xiàn)，TNF-α處

5、理48h后B16細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的脂滴，具有明顯的時效關(guān)系;
　　2.與對照組相比，TNF-α處理48h后B16細(xì)胞G1/G0期所占百分比顯著升高，3MA+TNF-α處理組的B16細(xì)胞G1/G0期的百分比高于TNF-α處理組;與對照組相比，TNF-α處理后B16 F10細(xì)胞G1/G0期所占百分比顯著升高，且具有明顯的時效關(guān)系;
　　3.在正常小鼠黑色素細(xì)胞mela細(xì)胞中，能夠檢測到p16基因，而黑色素瘤細(xì)胞B16和B16F10

6、細(xì)胞中未檢測到p16基因;
　　4.與對照組相比，TNF-α處理12h后B16細(xì)胞內(nèi)衰老標(biāo)志性基因p21 mRNA的表達(dá)變化不明顯，p53 mRNA的表達(dá)顯著升高;3MA+TNF-α處理12h后B16細(xì)胞中p21、p53 mRNA的表達(dá)水平較TNF-α處理組升高;
　　5.與對照組相比，TNF-α處理組B16細(xì)胞中p21、p53的下游關(guān)鍵基因CyclinE、E2F-1 mRNA的表達(dá)水平顯著降低，Rb mRNA的表達(dá)水平顯著

7、升高;
　　6.與對照組相比，經(jīng)TNF-α處理后的B16F10細(xì)胞中p21 mRNA的表達(dá)變化不明顯，p53 mRNA的表達(dá)水平顯著升高，到48h B16 F10細(xì)胞內(nèi)p53 mRNA的表達(dá)下降至初始水平;
　　7.與對照組相比，TNF-α處理的B16 F10細(xì)胞中p21、p53的下游關(guān)鍵基因CDK2、CDK4、CyclinE、E2F-1 mRNA的表達(dá)水平顯著下降;CyclinD mRNA的表達(dá)水平在24h時顯著升高，到4

8、8h時下降;Rb mRNA的表達(dá)變化不明顯;
　　8.與對照組相比，TNF-α處理組B16F10細(xì)胞內(nèi)LC3、Beclin1的表達(dá)升高且高于3-MA+TNF-α處理組;
　　9.與對照組相比，3-MA+TNF-α處理組B16細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平顯著升高，且高于TNF-α處理組;
　　10.與對照組相比，TNF-α處理組與3-MA+TNF-α處理組B16細(xì)胞RB蛋白的磷酸化水平顯著下降;
　　11.與對照組相

9、比，TNF-α處理12h后B16細(xì)胞內(nèi)E2F-1蛋白的表達(dá)下降，24h時E2F-1蛋白的表達(dá)上升至初始水平;
　　12.與對照組相比，TNF-α處理后B16細(xì)胞內(nèi)Ras-Raf-MAPK信號通路上的關(guān)鍵蛋白K-Ras和pErk的表達(dá)顯著升高，3-MA+TNF-α處理組B16細(xì)胞中K-Ras蛋白和Erk蛋白的磷酸化水平高于TNF-α處理組;
　　13.與對照組相比，TNF-α處理后B16細(xì)胞內(nèi)NF-κB的表達(dá)水平顯著升高，3-

10、MA+TNF-α處理組B16細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)水平高于TNF-α處理組。
　　結(jié)論：
　　1.TNF-α除了能夠誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞發(fā)生自體吞噬，還能夠誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16和B16F10細(xì)胞發(fā)生衰老。
　　2.TNF-α可能通過自體吞噬誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生衰老，且適度的自噬能夠延緩小鼠黑色素瘤細(xì)胞衰老。
　　3.TNF-α通過Ras-Raf-MAPK和P53-P21-Rb信號通路誘導(dǎo)B1