黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)的LSECtin抑制抗腫瘤T細(xì)胞免疫反應(yīng)并促進(jìn)小鼠黑色素瘤的生長.pdf

1、因?yàn)樵诤谏亓霾∪四[瘤組織內(nèi)能發(fā)現(xiàn)大量的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，所以黑色素瘤相比較其他類型的腫瘤更具免疫原性。即便如此，針對(duì)于黑色素瘤的免疫療法大多會(huì)失效，其主要原因是在這些黑色素瘤病人體內(nèi)腫瘤抗原特異性的CD8+T細(xì)胞大多失去了應(yīng)有的效應(yīng)功能。目前有很多研究都致力于揭示導(dǎo)致這些腫瘤抗原特異性的CD8+T細(xì)胞失去其效應(yīng)功能的內(nèi)在機(jī)制。這些機(jī)制主要包括:腫瘤細(xì)胞破壞抗原提呈細(xì)胞的功能;下調(diào)抗原提呈細(xì)胞HLA分子的表達(dá);上調(diào)腫瘤微環(huán)境中的抑制型因

2、子，包括IL-6和IL-10等細(xì)胞因子;招募更多的抑制型細(xì)胞，例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）和髓樣起源的抑制型細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)到腫瘤微環(huán)境中。近年來，T細(xì)胞免疫反應(yīng)共抑制分子的功能和應(yīng)用研究逐步受到重視。
　　肝臟和淋巴結(jié)竇內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(Liver Sinusoidal Endothelial Cell Lectin，LSEC

3、tin)是我們實(shí)驗(yàn)室從肝臟中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型跨膜C型凝集素受體，前期研究表明其特異的表達(dá)在肝臟和淋巴結(jié)中的竇內(nèi)皮細(xì)胞。其主要功能包括作為T細(xì)胞免疫反應(yīng)的共抑制分子，在肝臟內(nèi)抑制HBV病毒的清除，從而促進(jìn)肝臟對(duì)HBV的耐受。從免疫學(xué)的角度看，抗腫瘤免疫反應(yīng)和慢性病毒感染免疫反應(yīng)有許多類似之處，因此，我們想知道LSECtin作為T細(xì)胞免疫反應(yīng)的共抑制分子，是否抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)？
　　首先通過檢測(cè)包含有7種腫瘤組織RNA芯片中LSECtin

4、的表達(dá)，來篩選其中高表達(dá)LSECtin的腫瘤類型，我們發(fā)現(xiàn)黑色素瘤病人中LSECtin表達(dá)量較高，且大約有30％左右的病人相對(duì)于正常人來說，其LSECtin表達(dá)量明顯上調(diào)。接下來，我們進(jìn)一步檢測(cè)黑色素瘤病人組織RNA芯片中LSECtin的表達(dá)，在共計(jì)40例黑色素瘤病人組織中，有大約20例病人組織中LSECtin表達(dá)量相對(duì)于正常人的表達(dá)量明顯上調(diào)。在RNA水平上確認(rèn)了黑色素瘤病人組織中表達(dá)LSECtin之后，我們進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平，采用免

5、疫組織化學(xué)法檢測(cè)到黑色素瘤病人組織芯片中也表達(dá)LSECtin，同時(shí)采用流式分析法檢測(cè)到黑色素瘤病人的術(shù)后新鮮黑色素瘤細(xì)胞表面也表達(dá)LSECtin。至此，我們確認(rèn)黑色素瘤病人組織的確表達(dá)LSECtin。
　　國際上用于研究人黑色素瘤最好的動(dòng)物模型是給C57BL/6小鼠接種B16細(xì)胞，因此我們需要檢測(cè)B16細(xì)胞中LSECtin的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)不論是RNA水平還是蛋白質(zhì)水平，B16細(xì)胞中LSECtin的表達(dá)量都非常低，但是接種到小鼠

6、體內(nèi)的B16細(xì)胞在形成腫瘤之后，其LSECtin表達(dá)量明顯上調(diào)，這也就提示我們很可能是腫瘤微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)B16細(xì)胞上調(diào)LSECtin的表達(dá)。通過獲取小鼠黑色素瘤的組織提取物溶液模擬生理性的腫瘤微環(huán)境，我們發(fā)現(xiàn)其的確能夠上調(diào)LSECtin的表達(dá)，并且通過相應(yīng)的抗體封閉實(shí)驗(yàn)表明可能是腫瘤微環(huán)境中的IL-6和IL-10介導(dǎo)了這一上調(diào)。并且，外源的重組細(xì)胞因子IL-6和IL-10同樣能夠上調(diào)B16細(xì)胞LSECtin的表達(dá)。
　　在確認(rèn)B16

7、細(xì)胞本底表達(dá)LSECtin較低且在體內(nèi)腫瘤微環(huán)境中會(huì)被誘導(dǎo)上調(diào)這一現(xiàn)象之后，我們構(gòu)建了相應(yīng)的B16細(xì)胞過表達(dá)LSECtin的穩(wěn)定株B16-LSECtin及其對(duì)照穩(wěn)定株B16-mock。首先，我們確認(rèn)這兩株細(xì)胞在體外的生長能力并無差異。接下來通過給野生型或者LSECtin敲除型的C57BL/6小鼠接種B16-LSECtin或者B16-mock細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)無論是野生型還是LSECtin敲除型的小鼠，接種B16-LSECtin細(xì)胞之后，其生

8、長速度明顯快于接種B16-mock細(xì)胞的小鼠。為了確認(rèn)這一現(xiàn)象是否依賴于LSECtin，我們給野生型或者LSECtin敲除型的C57BL/6小鼠接種B16細(xì)胞，再同時(shí)注射LSECtin的抗體，我們發(fā)現(xiàn)無論是野生型還是LSECtin敲除型的小鼠，接種B16細(xì)胞之后，如果注射了LSECtin的抗體，其腫瘤生長速度明顯慢于注射對(duì)照抗體的小鼠。這些結(jié)果提示我們B16細(xì)胞表達(dá)的LSECtin會(huì)促進(jìn)小鼠黑色素瘤的生長。
　　結(jié)合LSECtin

9、的現(xiàn)有功能研究，我們猜想是否腫瘤細(xì)胞表達(dá)的LSECtin通過抑制T細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)來促進(jìn)小鼠黑色素瘤自身的生長。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，我們首先對(duì)接種B16-LSECtin或者B16-mock細(xì)胞的小鼠腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)二者腫瘤細(xì)胞的增殖情況和凋亡情況均無明顯差異，這就提示我們二者腫瘤生長速度的差異與腫瘤細(xì)胞自身的生長情況無關(guān)，而可能與機(jī)體的T細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)。因此，我們采用CD4和CD8分子的抗體，來清除小鼠體內(nèi)的C

10、D4+或者CD8+T細(xì)胞，然后再分別接種B16-LSECtin或者B16-mock細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)CD4+或者CD8+T細(xì)胞不存在的情況下，LSECtin過表達(dá)之后并不能使小鼠黑色素瘤的生長加快，這也就提示我們的確腫瘤細(xì)胞表達(dá)的LSECtin需要與T細(xì)胞相互作用來發(fā)揮其抑制功能，從而間接促進(jìn)腫瘤自身的生長。
　　為了進(jìn)一步明確腫瘤細(xì)胞表達(dá)的LSECtin是如何來抑制T細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，我們從兩個(gè)方面著手:其一是否會(huì)影響T細(xì)胞的增

11、殖，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)T細(xì)胞數(shù)目減少？其二是否會(huì)直接影響T細(xì)胞的效應(yīng)功能？通過分離檢測(cè)小鼠腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中各種類型T細(xì)胞的比例，我們發(fā)現(xiàn)接種B16-LSECtin細(xì)胞的小鼠，其腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中CD3+和CD8+T細(xì)胞的比例明顯低于接種B16-mock細(xì)胞的小鼠。通過相應(yīng)的體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，也表明LSECtin能夠抑制CD8+T細(xì)胞的增殖，但是不影響其凋亡。接下來，我們先給野生型C57BL/6小鼠接種B16-LSECtin和B16-mock細(xì)胞

12、，再分離其腫瘤引流淋巴結(jié)細(xì)胞以及脾臟細(xì)胞，分別使用IFN-γ胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法(ICS)和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)檢測(cè)這些細(xì)胞的效應(yīng)功能。我們發(fā)現(xiàn)小鼠接種B16-LSECtin細(xì)胞之后，其腫瘤引流淋巴結(jié)細(xì)胞以及脾臟細(xì)胞的效應(yīng)功能明顯減弱。另一方面，我們采用體外共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)體系，也表明腫瘤細(xì)胞表達(dá)的LSECtin能夠抑制CD8+T細(xì)胞IFN-γ的釋放。這些數(shù)據(jù)提示我們腫瘤細(xì)胞表達(dá)的LSECtin不僅可以抑制T細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)

13、T細(xì)胞數(shù)目減少，還能直接削弱腫瘤內(nèi)T細(xì)胞的效應(yīng)功能，從而整體上減弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)自身生長。在發(fā)現(xiàn)LSECtin的這一功能之后，我們想知道腫瘤細(xì)胞表達(dá)的LSECtin是與T細(xì)胞表達(dá)的什么分子進(jìn)行相互作用，來介導(dǎo)這一功能呢？通過對(duì)免疫抑制型受體相關(guān)文獻(xiàn)的挖掘并結(jié)合PRINCESS生物信息學(xué)工具的預(yù)測(cè)，我們獲得了幾個(gè)可能與LSECtin相互作用的分子，并通過表面離子共振法(SPR)篩選到其中LAG-3可以作為LSECtin相互作用

14、蛋白的候選分子。接下來，我們分別從物理上的相互作用，包括免疫共沉淀法（Co-immunopreiciation，Co-IP）、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)以及細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了LAG-3能夠與LSECtin發(fā)生物理上的相互作用。從功能上，通過使用LAG-3的封閉性抗體，我們發(fā)現(xiàn)將LAG-3封閉之后，不論是外源的重組LSECtin，還是腫瘤細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源LSECtin，其對(duì)T細(xì)胞效應(yīng)功能的抑制均得到一定程度的回復(fù)。這些數(shù)據(jù)提示我們腫瘤細(xì)胞

15、表達(dá)的LSECtin很有可能是與T細(xì)胞表達(dá)的LAG-3發(fā)生相互作用，從而抑制T細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而間接促進(jìn)腫瘤自身的生長。
　　綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示:LSECtin是表達(dá)在黑色素瘤細(xì)胞表面的共抑制分子，抑制T細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的生長。LAG-3是表達(dá)在T細(xì)胞表面的共抑制分子，LSECtin可能與LAG-3相互作用抑制T細(xì)胞IFN-γ的分泌。LSECtin在黑色素瘤中的功能研究，揭示了機(jī)體對(duì)于黑色素瘤免疫耐