Capn4干擾對人黑色素瘤細胞增殖和遷移的抑制作用及其機制研究.pdf

1、目的：黑色素瘤是惡性程度最高的惡性腫瘤之一，晚期黑色素瘤患者總生存期低，預后差。做為預后最差的皮膚惡性腫瘤，近年來，其在世界范圍內(nèi)的其發(fā)病率和死亡率均持續(xù)上升。眾所周知，在原發(fā)灶切除后，黑色素瘤有很高的復發(fā)、轉(zhuǎn)移風險。且轉(zhuǎn)移性黑色素瘤對高劑量IFN-α2b、化療、放療、免疫治療以及新近發(fā)展起來的分子靶向治療等治療手段均表現(xiàn)出高抵抗性。對于那些沒有BRAF突變以及BRAF突變患者經(jīng)BRAF抑制劑治療后進展的患者，幾乎沒有特別有效的治療手段

2、可以選擇。因此，深入研究黑色素瘤的轉(zhuǎn)移機制和尋找一種可能的治療手段顯得十分必要。目前，大量的研究結(jié)果支持鈣蛋白酶在腫瘤細胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移中起作用。鈣蛋白酶是一類細胞內(nèi)鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶家族，它包括無處不在的μ-鈣蛋白和m-蛋白。μ-鈣蛋白和 m-鈣蛋白均形成異二聚體，二聚體分別包括被鈣蛋白酶1（Capn1）基因和鈣蛋白酶2基因（ Capn2）編碼的80 kDa的催化亞單位和被Capn4基因（CAPNS1，鈣蛋白酶小亞基1）編碼的

3、28 kDa調(diào)節(jié)亞單位。在過去的幾十年中，大量研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶的活性與多種生理過程及病理過程有關。這些生理過程包括細胞支架的重建、細胞信號、凋亡和細胞生存；病理過程包括腫瘤細胞的粘附、遷移和侵襲等過程。μ-鈣蛋白和m-鈣蛋白在骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、肝細胞癌、結(jié)直腸癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤中異?；罨?。作為鈣蛋白酶亞單位之一的Capn4，其功能也包括了調(diào)節(jié)腫瘤細胞凋亡、遷移和侵襲等等。目前研究發(fā)現(xiàn)，Capn4與多種腫瘤的遷移、侵襲有關，如：下

4、調(diào)Capn4抑制了腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、遷移，降低了金屬蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白（vimentin）和N-鈣蛋白（N-cadherin）的水平。Capn4的過表達與肝癌、肝內(nèi)膽管癌（ICC）、腎透明細胞癌(ccRCC)、鼻咽癌(NPC)、非小細胞肺癌（NSCLC）的侵襲和轉(zhuǎn)移有關。Capn4被認為可能作為HCC、ICC、NPC的一種分子靶向治療手段。研究證實，多種通路在惡性腫瘤細胞的遷移和侵襲中起調(diào)節(jié)作用，這些通路包括Wnt/β-c

5、atenin（β-catenin）信號通路、EMT和NF-κB(p65)通路等。廣泛存在的β-catenin信號通路被稱為促進腫瘤進程的“致瘤”信號通路，它影響惡性腫瘤細胞粘附、生長和分化等細胞進程。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在多種腫瘤細胞中核內(nèi)是增高的。異常的Wnt/β-catenin信號通路被發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤的發(fā)生中起重要作用。EMT是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中最重要的事件之一，EMT通過改變腫瘤周圍的微環(huán)境以利于腫瘤細胞從原發(fā)部位向遠處轉(zhuǎn)

6、移。研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶在EMT中亦發(fā)揮作用。在EMT過程中，E-鈣蛋白（E-cadherin）被下調(diào)，N-鈣蛋白（N-cadherin）和vimentin被上調(diào)。NF-κB在不同腫瘤模型中表現(xiàn)出促進腫瘤進展的功能。它在黑色素瘤細胞中也表現(xiàn)出高活性。有研究報道，在黑色素瘤腫瘤的發(fā)生進程中，NF-κB起調(diào)節(jié)作用。大量的研究證實，β-catenin信號通路、EMT通路和NF-κB（P65）信號通路之間存在“相互對話”，并且互相影響活性及功能。

7、如：體內(nèi)外試驗發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌細胞中抑制β-catenin信號通路的活性，可以抑制癌細胞的生長和EMT進程。在結(jié)腸癌細胞和乳腺癌細胞中，β-catenin信號通路和NF-κB通路相互影響。體內(nèi)外試驗發(fā)現(xiàn)，敲除Capn4抑制細胞遷移、侵襲。下調(diào)Capn4抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移、侵襲，且降低了vimentin和 N-cadherin的表達水平。通過分析GEO：GSE3189基因芯片，發(fā)現(xiàn)Capn4在黑色素瘤組織中高表達。目前Capn4在黑色素

8、瘤中的作用機制尚不明確，本研究以β-catenin及EMT為靶向切入點，研究Capn4在惡性黑色素瘤細胞中的作用及機制，旨在發(fā)掘黑色素瘤細胞可能的遷移及侵襲機制、提供一種新的惡性黑色素瘤的分子靶向治療奠定實驗及理論基礎。
　　方法：⑴從重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院收集黑色素瘤組織120例，正常組織34例供免疫組化用。把黑色素瘤組織及正常組織用多聚甲醛固定，然后經(jīng)過不同濃度的酒精梯度脫水，再用二甲苯透明，然后用石蠟包埋。然后讓其自然冷卻

9、、凝固，然后切片。經(jīng)甲醛固定、脫水、烤片等處理。為了封閉抗原中的部分非特異性位點，我們在組織切片上滴加山羊血清工作液，再在每張切片上加1滴第一抗體（一抗 Capn4）。經(jīng)相關處理后在每張組織切片上加1滴酶標抗兔的第二抗體（辣根過氧化物酶標記），在室溫下孵育30min。經(jīng)孵育、洗滌后在組織切片上滴加 DAB工作液。在光學顯微鏡下觀察組織切片的顯色情況，當觀察到淡黃色時，就判斷為陽性表達，隨即終止顯色。再經(jīng)沖洗、蘇木素染核、酒精梯度脫水等處

10、理。本部分實驗均由兩名病理科醫(yī)師獨立閱片以及記錄結(jié)果。組織切片中細胞核或細胞漿出現(xiàn)（棕）黃色顆粒即為Capn4目的蛋白的陽性表達。⑵將人黑色素瘤細胞株A375、SK-MEL-1、MV3、M14以及HaCaT細胞培養(yǎng)于相應的培養(yǎng)基中。待細胞生長到融合度約達80％時，用胰酶消化傳代，傳代后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)。用細胞刮刮下貼壁生長的細胞并將細胞轉(zhuǎn)移到EP管中，棄去上清液，加入細胞裂解液。采用 BCA蛋白濃度測定試劑盒來檢測所提取的蛋白樣品濃度，以

11、細胞蛋白抽提裂解液為空白對照。吸光度值測定波長調(diào)整為562nm，依次測定各樣品的吸光度值，每份細胞標本均測定3個測定值，取這三個反應值的均值作為結(jié)果。聚丙稀酰胺凝膠電泳，以目的蛋白的大小為依據(jù)，切下所需的膠條。經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉等處理，將已稀釋好的Capn4一抗均勻滴于蠟板上，過夜后再加入二抗（辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP））孵育。再滴加適量ECL顯影液于蠟板上。放入凝膠成像儀中顯影。內(nèi)參蛋白的灰度值及目的蛋白的灰度

12、值均通過Quantity one軟件計算后得到。目的蛋白的相對表達量為：目的蛋白（Capn4）與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值之比。⑶根據(jù)目的基因Capn4設計3個靶點（shRNA1、shRNA2、shRNA3）做為實驗組以及1個無干擾功能的靶點為做對照組（Control shRNA）。把單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列（寡聚T核苷序列），連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體。測序驗證正確的轉(zhuǎn)化子，進行高純度質(zhì)粒抽提。將黑色素瘤細胞株A3

13、75培養(yǎng)于DMEM+10%FBS的培養(yǎng)基中，當細胞生長至融合度達80%左右時，加入胰酶消化傳代，傳代后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，為后續(xù)實驗做準備。將黑色素瘤細胞株A375分成四組實驗：1組為對照組（con，Control shRNA），3組為實驗組（shRNA1、shRNA2、shRNA3）。將構(gòu)建的Capn4干擾載體分別轉(zhuǎn)染到細胞株中，轉(zhuǎn)染成功后提取蛋白，“蛋白提取、電泳及灰度分析”步驟同“1.2 WB檢測黑色素瘤細胞及HaCaT細胞中Capn

14、4的表達”中的步驟。取每份細胞株3次試驗的平均值做統(tǒng)計學分析。⑷實驗將A375/M14兩種細胞分別分成兩組：對照組 con(Control shRNA)及實驗組shRNA（shRNA1）。將A375細胞株及M14細胞株培養(yǎng)于相應的培養(yǎng)基中。取1.5×105個處于對數(shù)生長期的A375/M14細胞接種于六孔板內(nèi)，當融合率達到60%左右時進行轉(zhuǎn)染。將DNA-Lipofectamine2000復合物添加到細胞中、轉(zhuǎn)染。用WB法檢測轉(zhuǎn)染成功細胞的

15、Capn4的表達?！耙豢埂⒍?、蛋白提取、電泳及灰度分析”步驟同“1.2 WB檢測黑色素瘤細胞及HaCaT細胞中Capn4的表達”中的步驟。取每份細胞株3次試驗的平均值做統(tǒng)計學分析。⑸分別將A375細胞株、M14細胞株培養(yǎng)于相應的培養(yǎng)基中。將前期構(gòu)建的Capn4干擾載體轉(zhuǎn)染到A375和M14細胞株中。含有干擾Capn4功能的 shRNA載體為 shRNA實驗組，含有無干擾功能的 Control shRNA載體為con對照組，共4組細胞。

16、轉(zhuǎn)染方法同“2.2細胞轉(zhuǎn)染”。在96孔板的每孔鋪90μl含細胞的細胞懸液，即每孔含2.0×103 cells。每孔中各加10μl的5mg/ml的MTT液孵育，在第1d、2d、3d、4d、5d的時間點連續(xù)檢測。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上選擇450nm波長測定各孔光吸收值，即450nm波長測OD值（optical density，光密度），并記錄結(jié)果。取每份細胞標本3次試驗的平均值進行統(tǒng)計學分析。SPSS軟件根據(jù)平均值畫出A375及M13細胞的生長

17、曲線（以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線）。⑹細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法同前。將前期構(gòu)建的Capn4干擾載體轉(zhuǎn)染到A375和M14細胞株中。含有干擾Capn4功能的shRNA載體為shRNA實驗組，含有無干擾功能的Control shRNA載體為con對照組。分別將A375/M14實驗組及對照組細胞配成1×106個細胞/ml的細胞懸液；在鋪有載玻片的24孔板中按每孔2×104個細胞進行接種，在孵箱中培養(yǎng)12h后用4%多聚甲醛固定等處

18、理，再將TUNEL染色液加入每孔中，避光條件下孵育1h。孵育結(jié)束的細胞一部分直接用于TUNEL熒光分析、一部分用于DAPI實驗。將用于DAPI實驗的細胞用PBS浸洗3次后加入DAPI染色液進行細胞核染色，染色10 min后洗滌。將TUNEL染色及DAPI染色的細胞分別用抗熒光淬滅封片液封片，染后在熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)TUNEL陽性細胞，觀察DAPI染色細胞的形態(tài)。⑺細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法同前。將前期構(gòu)建的Capn4干擾載體轉(zhuǎn)染到A375和

19、M14細胞株中。含有干擾Capn4功能的shRNA載體為shRNA實驗組，含有無干擾功能的Control shRNA載體為con對照組。一抗為cleaved-caspase3，其余實驗步驟，如：蛋白的提取、電泳、灰度分析等同前。目的蛋白的相對表達量為：目的蛋白（Claeved-Caspase-3）與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值之比。取每種細胞株3次試驗的平均值做統(tǒng)計學分析。⑻遷移實驗：分別將A375細胞株、M14細胞株培養(yǎng)于相應的培養(yǎng)基

20、中。將前期構(gòu)建的Capn4干擾載體轉(zhuǎn)染到 A375和M14細胞株中（shRNA實驗組），含有無干擾功能Control shRNA載體的細胞為（con）對照組。取3×105 cells加入到Transwell小室中，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)48h-96h后將上室內(nèi)的培養(yǎng)基去掉，用棉棒將上室內(nèi)的細胞去掉，用結(jié)晶紫染色液進行染色。染色后用顯微鏡拍照、計數(shù)。侵襲實驗：在“遷移實驗”步驟的“將細胞加入Transwell小室”前，加做

21、步驟：“用1：8稀釋的Matrigel液包被Transwell小室底部膜的上室面，使其聚合成凝膠”，其余步驟與“遷移實驗”相同。⑼A375細胞培養(yǎng)及Capn4干擾（shRNA轉(zhuǎn)染）方法同前。將出生滿五周的BALB/c雄裸鼠隨機分成2組（實驗組：shRNA組；對照組：con組），每組3只。每只BALB/c裸鼠左側(cè)腹部皮下注射5×106個細胞。從第十天開始檢測各組腫瘤體積，麻醉后游標卡尺測腫瘤體積，腫瘤體積（單位：mm3）=長×寬×寬/2。

22、每周記錄一次。觀察腫瘤體積。第四周后以頸椎脫臼致死法處死裸鼠取得腫瘤組織。⑽分別將A375細胞株、M14細胞株培養(yǎng)于相應的培養(yǎng)基中。將前期構(gòu)建的Capn4干擾載體轉(zhuǎn)染到A375和M14細胞株中（shRNA轉(zhuǎn)染）實驗組，含有無干擾功能Control shRNA載體的細胞為（con）對照組。一抗為Capn4、β-catenin-T（總蛋白）、β-catenin-N（核蛋白）、E-cadherin、N-cadherin、vimentin，以G

23、APDH為內(nèi)參、CDK4為β-catenin-N核內(nèi)參。其余實驗步驟，如：蛋白的提取、電泳、灰度分析等同前。目的蛋白的相對表達量為：目的蛋白（ Capn4、β-catenin-T、E-cadherin、N-cadherin、vimentin）分別與內(nèi)參蛋白（ GAPDH）灰度值之比；β-catenin-N與核內(nèi)參蛋白（CDK4）灰度值之比，取每種細胞株3次試驗的平均值做統(tǒng)計學分析（采用t檢驗，均數(shù)+標準差（SD）。P<0.05：差異有統(tǒng)

24、計學意義）。
　　結(jié)果：①黑色素瘤組織免疫組化染色計分方法：A：陽性細胞計分（0-3分）， B：組織中陽性細胞百分率計分（0-3分）。M：黑色素瘤組織陽性計分（0-9分）。計算式：分數(shù)值（M）=A× B。M：0-4分為低表達，5-9分為高表達。黑色素瘤組織中Capn4高表達率約為66.67%(80/120)，而正常組織標本中Capn4高表達率約為20.59%(7/34)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。②WB檢測發(fā)現(xiàn)A375、

25、M14、SK-MEL-1、MV3四種黑色素瘤細胞中Capn4的表達均高于正常細胞HaCaT中Capn4的表達。以Quantity one軟件分析灰度值，Capn4在各黑色素瘤細胞系中的表達均顯著高于在HaCaT細胞系中的表達，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。③采用WB法，以GAPDH為內(nèi)參，和對照組相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3三個靶點均起到較好的干擾Capn4的效果，具有顯著性差異（P﹤0.01）。其中shRNA1

26、靶點效果最好，用shRNA1靶點進行后續(xù)實驗。④采用WB法，以GAPDH為內(nèi)參，和對照組相比，shRNA1可以顯著降低M375/M14細胞中Capn4的表達（P﹤0.05）。以SPSS軟件分析Quantity one軟件所得的灰度值，Capn4在shRNA干擾的A375/M14細胞中的表達均顯著低于對照組細胞（P<0.05）。shRNA1靶點干擾效果好且穩(wěn)定，可以作為后續(xù)實驗的干擾靶點。⑤實驗組的OD值低于對照組。與對照組相比，shRN

27、A干擾的A375及M14細胞均表現(xiàn)出低活性，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑥干擾Capn4的A375/M14細胞的TUNEL陽性細胞百分比高于對照組（P﹤0.01）；Capn4干擾細胞中TUNEL片段多于對照組，DAPI染色提示shRNA轉(zhuǎn)染細胞中細胞膜形態(tài)的變化多于對照組，TUNEL及DAPI原位融合支持上述結(jié)果。⑦采用WB法，以GAPDH為內(nèi)參，Quantity one軟件分析灰度值。和對照組相比，實驗組的灰度值高于對照組。S

28、PSS軟件分析灰度值結(jié)果，和對照組相比，shRNA轉(zhuǎn)染（干擾Capn4）可以顯著增加M375/M14細胞中cleaved-caspase3蛋白的表達（P﹤0.01）。⑧Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)，在侵襲實驗及遷移實驗中，Capn4干擾（ShRNA-轉(zhuǎn)染）的A375/M14細胞，其侵襲及遷移數(shù)量均顯著低于對照組，每組細胞取3次實驗的平均值用于統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑨和對照組相比，注射Capn4干擾細胞的實驗組B

29、ALB/c鼠，腫瘤生長速度明顯慢于對照組。取每組3只老鼠腫瘤體積的平均值，以t檢驗為統(tǒng)計學分析方法，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。⑩采用WB法，以GAPDH為內(nèi)參，和對照組相比，Capn4干擾（shRNA組，即shRNA1轉(zhuǎn)染）可以顯著降低M375/M14細胞中Capn4的表達（P﹤0.05）。
　　結(jié)論：⑴Capn4在黑色素瘤組織及細胞中的表達顯著高于正常組織及HaCaT細胞，shRNA轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒可以干擾（下調(diào)）Capn4