SB--431542對黑色素瘤細胞增殖及其LDH、Nodal蛋白表達的影響.pdf

1、目的：探討低氧環(huán)境、Nodal抑制劑（SB-431542）對黑色素瘤細胞增殖的影響;探討低氧環(huán)境、SB-431542對黑色素瘤細胞中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)同工酶亞基(LDH-A、LDH-B)、Nodal(Nodal growth differentiation factor)及其受體ALK4(Activin receptor-like kinase4)、ALK7(Activin receptor

2、-like kinase7)蛋白的表達及LDH同工酶譜的影響;探討低氧環(huán)境、SB-431542是否通過影響LDH、Nodal及其受體的表達來影響黑色素瘤(Malignant melonoma，MM)的發(fā)生發(fā)展過程;以及探討LDH、Nodal在黑色素瘤能量代謝方面是否具有相關(guān)性;從而為黑色素瘤在臨床上的診斷及治療提供新的思路。
　　方法：在體外使用氯化鈷誘導(dǎo)黑色素瘤細胞A375低氧，構(gòu)建低氧模型，模擬其在人體內(nèi)生存的微環(huán)境。用SB-

3、431542干預(yù)細胞，通過MTT法檢測低氧環(huán)境、SB-431542對A375細胞增殖活性的影響，探索細胞增殖的最適作用濃度及最佳作用時間。采用Western Blot的方法檢測低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factor，HIF-1α）蛋白表達水平，根據(jù)其表達水平的高低以明確低氧模型是否制造成功，并檢測低氧環(huán)境及SB-431542對LDH-A、LDH-B、Nodal及其受體ALK4、ALK7蛋白表達的影響;采用瓊脂糖凝

4、膠電泳的方法檢測低氧環(huán)境、SB-431542對乳酸脫氫酶同工酶譜活性的影響。
　　結(jié)果：1.MTT法檢測CoCl2誘導(dǎo)形成的低氧環(huán)境對黑色素瘤A375細胞的增殖的影響：CoCl2在適宜濃度范圍內(nèi)(50-200uM)對細胞增殖無明顯抑制作用(P＞0.05)，當(dāng)超過一定的濃度范圍(250uM)后隨著其作用濃度和作用時間的的增加，表現(xiàn)出抑制作用。當(dāng)CoCl2的濃度為150uM時，細胞增殖在48h達高峰。SB-431542對MM細胞增殖的

5、影響：當(dāng)SB-431542作用濃度逐漸增加，作用時間逐漸延長，細胞的增殖能力呈現(xiàn)下降的趨勢。濃度小于10uM抑制作用較弱;濃度為10-20uM表現(xiàn)出一定的抑制作用;當(dāng)濃度超過30uM后呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。CoCl2與SB-431542共同作用對細胞增殖的影響：當(dāng)SB'-431542作用濃度為10uM恒定不變時，CoCl2的濃度在50-150uM范圍內(nèi)對細胞增殖無抑制作用(P＞0.05)，當(dāng)CoCl2濃度超過200uM后表現(xiàn)出明顯抑制作

6、用。當(dāng)SB-431542作用濃度為10uM，同時CoCl2作用濃度為150uM時，細胞的增殖在48h達最高峰。
　　2.Western Blot技術(shù)檢測結(jié)果顯示：適宜濃度的CoCl2成功誘導(dǎo)A375細胞形成低氧模型后，HIF-1α呈現(xiàn)高表達，同時可見LDH-A、Nodal、_ALK4、ALK7蛋白的高表達，LDH-B蛋白低表達（P＜0.05），SB-431542可上調(diào)LDH-B蛋白表達，下調(diào)LDH-A、Nodal、ALK4、ALK

7、7蛋白的表達(P＜0.05)。
　　3.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：低氧環(huán)境可增加LDH同工酶譜中LDH5的活性，而SB-431542可降低LDH5的活性(P＜0.05)。
　　結(jié)論：1.適宜濃度的CoCl2在適宜時間可成功誘導(dǎo)黑色素瘤細胞低氧環(huán)境模型。低氧環(huán)境具有促進黑色素瘤細胞增殖及能量代謝的作用，其機制可能與HIF-1α、LDH-A、Nodal及其受體的高表達，LDH-B的低表達有關(guān)。
　　2.SB-431542具有