致弱水泡性口炎病毒對惡性黑色素瘤抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　脈絡(luò)膜黑色素瘤(choroidal melanoma，CM)是成年人最常見的眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，可在腫瘤早期隨血行播散，CM一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，死亡率極高。傳統(tǒng)的治療方法是眼球摘除術(shù)，近幾十年出現(xiàn)多種保眼治療的方法，如放射治療，局部切除術(shù)，經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?，激光光凝?這些新的治療方法雖然實(shí)現(xiàn)了保留眼球、維持部分視功能的作用，但未能明顯改善脈絡(luò)膜黑色素瘤的轉(zhuǎn)移率和生存率。近年來，腫瘤生物治療成為新興且療效顯著的腫瘤治療新模式，

2、其中的溶瘤病毒治療作為生物療法之一在多種腫瘤的研究中顯示出較好的腫瘤殺傷作用。水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)具有遺傳適應(yīng)性強(qiáng)，病毒拯救體系成熟高效，病毒復(fù)制迅速等特點(diǎn)，是腫瘤治療的良好載體。由于眼部解剖的特殊性，對脈絡(luò)膜黑色素瘤的治療需要對眼部健康組織友好的VSV突變株。本研究嘗試對野生型水泡性口炎病毒(WT-VSV)進(jìn)行突變拯救出對神經(jīng)組織更為安全的致弱型VSV，研究WT-VSV與致弱V

3、SV毒株對體外培養(yǎng)的惡性黑色素瘤細(xì)胞特異性殺傷作用及在體內(nèi)的抗腫瘤作用，并探討其抗腫瘤作用方式及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.拯救實(shí)驗(yàn):利用VSV反向遺傳系統(tǒng)和定點(diǎn)突變技術(shù)，對野生型VSV的1650與1691位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行突變成功拯救獲得VSV-Y1650A與VSV-F1691A兩株致弱水泡性口炎病毒株。
　　2.噬神經(jīng)性實(shí)驗(yàn):通過VSV滴鼻感染小鼠后進(jìn)行神經(jīng)組織的HE及免疫組化檢測了解野生型VSV與新拯救的VS

4、V-Y1650A與VSV-F1691A噬神經(jīng)作用特點(diǎn)。
　　3.體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn):使用BHK-21細(xì)胞擴(kuò)增三種VSV病毒，應(yīng)用TCID50法測定病毒滴度;以體外培養(yǎng)的小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞為研究對象，通過CCK-8法檢測比較不同毒株VSV病毒對B16細(xì)胞增殖的影響，并通過流式細(xì)胞儀檢測不同毒株VSV對B16細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　4.體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn):利用小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞經(jīng)皮下注射構(gòu)建裸鼠實(shí)體荷瘤模型，瘤體內(nèi)注

5、射接種VSV-WT與VSV-Y1650A，通過觀察腫瘤生長趨勢、Westernblot法檢測腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討VSV的體內(nèi)抑瘤作用效果以及相關(guān)的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.利用單股負(fù)鏈RNA病毒反向基因操作技術(shù)，對野生型VSV基因組內(nèi)L蛋白VI功能域的1650與1691位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行突變成功拯救獲得VSV-Y1650A與VSV-F1691A兩株致弱的水泡性口炎病毒突變株。
　　2.WT，Y1650

6、A，F(xiàn)1691A三株VSV分別滴鼻感染小鼠后7天腦部病理切片顯示，接種WT-VSV的小鼠腦部出現(xiàn)腦部血管充血，腦實(shí)質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤呈袖套反應(yīng)等溫和的病理變化，而Y1650A和F1691A組小鼠腦部未觀察到顯著的病理變化。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)中CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)WT，Y1650A，F(xiàn)1691A三株VSV均對B16細(xì)胞有明顯殺傷作用，且殺傷作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系。流式細(xì)胞儀檢測三組VSV病毒作用于B16細(xì)胞72h后，與空白組相比，其晚期凋

7、亡細(xì)胞的比例均極顯著上升(44.44％/WT,28.36％/Y1650A，24.19％/F1691A vs2.14％，P＜0.01)。流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示，感染病毒的三組均出現(xiàn)G1期細(xì)胞數(shù)量減少;WT-VSV組(67.96％ vs86.42％, P＜0.01); Y1650A-VSV組(76.42％ vs86.42％, P＜0.05); F1691A-VSV組(81.70％ vs86.42％，P＞0.05);相比，其S期細(xì)胞均有明顯的上

8、升，感染過VSV的B16細(xì)胞有明顯的S期阻滯的現(xiàn)象。
　　4.裸鼠荷瘤模型的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接種VSV-WT與VSV-Y1650A均可以明顯的抑制小鼠體內(nèi)接種的B16腫瘤的生長，而未見明顯的毒副反應(yīng)。Westernblot法檢測腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示，WT與Y1650A能上調(diào)小鼠惡性黑色素瘤組織中的caspase-3，Bax基因的蛋白的表達(dá);同時(shí)可以抑制小鼠惡性黑色素瘤組織中CDK-2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:<

9、br>　　1.拯救獲得VSV-Y1650A與VSV-F1691A兩株致弱的水泡性口炎病毒突變株的噬神經(jīng)性較WT-VSV明顯減弱。
　　2.WT，Y1650A，F(xiàn)1691A三株VSV在體外能夠殺傷B16腫瘤細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中能夠抑制腫瘤生長，且無明顯的毒副反應(yīng)。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞凋亡檢測及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的凋亡相關(guān)蛋白檢測均提示VSV殺傷B16細(xì)胞的機(jī)制與細(xì)胞凋亡的途徑有關(guān)。
　　綜上所述，