VEGF抑制TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化作用中Notch信號(hào)系統(tǒng)的變化.pdf

1、第一部分 VEGF抑制TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化作用中Notch信號(hào)系統(tǒng)的變化
　　 目的:
　　 腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同病理過(guò)程。腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是腎間質(zhì)纖維化的重要的機(jī)制之一。EMT受多種因素調(diào)節(jié),既有促進(jìn)EMT的因子,也有對(duì)EMT起抑制作用的因子。TGF-β1是促進(jìn)EMT的重要細(xì)胞因

2、子。Notch信號(hào)傳導(dǎo)在TGF-β1誘導(dǎo)腎小管EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)VEGF對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT有抑制作用,但具體作用機(jī)制尚不十分清楚。VEGF可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch信號(hào)分子表達(dá)。在血管新生過(guò)程中,VEGF、TGF-β1和Notch存在交互對(duì)話。Notch信號(hào)途徑可能是VEGF抑制TGF-β1誘導(dǎo)腎小管EMT的作用靶點(diǎn)之一。
　　 本研究旨在探討應(yīng)用VEGF干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞

3、EMT過(guò)程中Notch信號(hào)系統(tǒng)的變化及其意義。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)1:體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞分為T(mén)GF-β1(5μg/L)單獨(dú)作用組(T組)和TGF-β1(5μg/L)與VEGF(100μg/L)共同作用組(T+V組),應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)作用0、2、4、8、24小時(shí)Jagged-1和α-SMA mRNA表達(dá),應(yīng)用Westernblot方法檢測(cè)0、2、4、8、12、24、48小時(shí)Jagged-1和α—SMA蛋白

4、表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)2:體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、TGF—β1(5μg/L)單獨(dú)作用組、VEGF165(100μg/L)單獨(dú)作用組、TGF-β1(5μg/L)與不同濃度VEGF165(0.1、1、10、100μg/L)共同作用組,作用細(xì)胞24小時(shí),應(yīng)用免疫組化雙染觀察α—SMA和E-cadherin蛋白表達(dá),激光共聚焦顯微鏡方法觀察α-SMA蛋白表達(dá),應(yīng)用RT-PCR、Western Blot檢測(cè)細(xì)胞α-SMA、Jag

5、ged-1、Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同作用時(shí)間VEGF對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA及Jagged-1表達(dá)的影響
　　 T組α-SMA mRNA表達(dá)在作用后2小時(shí)較基礎(chǔ)值明顯升高,T+V組則在8小時(shí)后才明顯升高；T組α-SMA蛋白表達(dá)在作用后4小時(shí)較基礎(chǔ)值明顯升高,T+V組則在12小時(shí)后才明顯升高；作用后24和48dx時(shí),T+V組α-SMA蛋白表達(dá)明顯低于T組。
　　

6、 T組Jagged-1 mRNA表達(dá)升高呈雙峰樣,即在作用后4和24小時(shí)較基礎(chǔ)值明顯升高,而8小時(shí)無(wú)明顯變化,T+V組Jagged-1 mRNA表達(dá)也在4和24小時(shí)明顯升高,但各時(shí)點(diǎn)表達(dá)均有低于T組的趨勢(shì)；T組Jagged-1蛋白表達(dá)在作用后4小時(shí)較基礎(chǔ)值明顯升高,T+V組則在8小時(shí)后才明顯升高；作用后24和48小時(shí),T+V組Jagged-1蛋白表達(dá)明顯低于T組。
　　 2.不同濃度VEGF165對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的E—cadh

7、erin、α-SMA、Jagged-1及Notch1表達(dá)的影響
　　 免疫組化雙染顯示,TGF-β1作用后,HK-2細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減弱而α-SMA表達(dá)增強(qiáng)。同TGF-β1作用組比較,VEGF165(100μg/L)與TGF—β1共同作用組α-SMA表達(dá)明顯減弱而E-cadherin表達(dá)明顯增加。隨VEGF165濃度下降,α—SMA表達(dá)逐漸增加而E—cadherin表達(dá)逐漸減弱。
　　 激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)

8、現(xiàn),TGF—β1作用后,HK-2細(xì)胞胞漿α-SMA表達(dá)明顯增強(qiáng)。同TGF-β1作用組比較,VEGF165(100μg/L)與TGF-β1共同作用組α-SMA表達(dá)明顯減弱,隨VEGF165濃度下降,α-SMA表達(dá)逐漸增加。
　　 RT-PCR、Western Blot結(jié)果顯示,與TGF-β1單獨(dú)作用組相比,TGF—β1與VEGF165(100μg/L)共同作用組,α-SMA、Jagged—1及Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)較TG

9、F-β1(5μg/L)單獨(dú)作用組均明顯降低(P＜0.05)。隨著VEGF165濃度下降,對(duì)α-SMA、Jagged-1及Notch1表達(dá)的抑制作用減弱。VEGF165單獨(dú)作用組與陰性對(duì)照組相比,Jagged-1及Notch1表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 VEGF以劑量依賴方式抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞發(fā)生EMT,并同樣以劑量依賴方式下調(diào)HK2細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程中Jagged-1、Notch1分子表達(dá),提示該

10、效應(yīng)可能為VEGF抑制TGF—β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT的機(jī)制之一。
　　 第二部分舒洛地特對(duì)UUO小鼠腎間質(zhì)纖維化的作用及其機(jī)制探討
　　 目的:
　　 眾所周之,腎間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致各種慢性腎病疾病進(jìn)展至終術(shù)期腎衰竭的重要機(jī)制。腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。EMT受多種因子調(diào)節(jié),其中TGF-β1

11、是促進(jìn)EMT和腎間質(zhì)纖維化的重要細(xì)胞因子,研究證實(shí)Notch通路是TGF-β1誘導(dǎo)腎小管EMT過(guò)程中的重要信號(hào)途徑；而VEGF等因子可抑制腎小管EMT和腎間質(zhì)纖維化。舒洛地特是從豬小腸粘膜提取的天然物質(zhì),由四種糖胺聚糖組成。已有研究證實(shí)舒洛地特可影響試驗(yàn)動(dòng)物和人體TGF-β1、TNF-α、HGF等EMT和腎間質(zhì)纖維化相關(guān)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示多種糖胺聚糖類物質(zhì)可抑制器官纖維化,但不同種類糖胺聚糖及不同動(dòng)物模型其結(jié)果不盡一致

12、。目前尚無(wú)舒洛地特對(duì)腎間質(zhì)纖維化作用的報(bào)道。
　　 本研究旨在探索舒洛地特對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)小鼠腎臟間質(zhì)纖維化的作用,及其對(duì)EMT和腎組織Jagged-1、Notch1表達(dá)的影響,探討其可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 雄性CD1小鼠78只隨機(jī)分為:A.假手術(shù)組(腹膜切開(kāi)后縫合)；B.UUO+NS(單側(cè)輸尿管結(jié)扎,術(shù)后予生理鹽水0.1ml/d皮下注射)；C.UUO+LS(單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后予舒洛地特6mg/

13、kg/d皮下注射,)；D.UUO+HS(單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后予舒洛地特12mg/kg/d皮下注射)；E.UUO+3dHS(單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后第三天予舒洛地特12mg/kg/d皮下注射)。A、B、C、D組動(dòng)物分別于術(shù)后第3天、7天、14天處死6只,E組6只于術(shù)后第7天處死,取輸尿管結(jié)扎側(cè)腎皮質(zhì)組織。腎臟標(biāo)本行HE、Masson染色檢測(cè)腎間質(zhì)纖維化程度。應(yīng)用免疫組化、WesternBlot、RT-PCR檢測(cè)腎臟組織中α-SMA、TGF-β1、

14、VEGF、Jagged-1和Notch1表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 HE染色顯示,UUO術(shù)后腎臟間質(zhì)區(qū)域細(xì)胞外基質(zhì)成分逐漸增多,腎小管萎縮,細(xì)胞成分減少,而腎小球病變不明顯。舒洛地特治療后UUO小鼠腎臟組織學(xué)變化減輕,大劑量組效果更為顯著。Masson染色顯示,UUO組小鼠腎組織出現(xiàn)明顯腎間質(zhì)纖維化,舒洛地特抑制腎間質(zhì)纖維化(P＜0.001),且早期治療組(D組,7d)較晚期開(kāi)始治療組(E組)腎間質(zhì)纖維化程度明顯較輕(P

15、＜0.05)。與假手術(shù)組比較,UUO組腎組織α-SMA、TGF-β1和Jagged-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)；舒洛地特治療組α-SMA、TGF-β1和Jagged-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于UUO組(P＜0.05)。UUO組和假手術(shù)組比較,VEGF mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05),舒洛地特治療后VEGF mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。未檢測(cè)出小鼠腎組織中Notch1表達(dá)。
　　 結(jié)論: