Twist誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變?cè)诟渭?xì)胞癌血管生成中的作用.pdf

1、目的：研究肝細(xì)胞癌(HCC)中是否存在血管生成擬態(tài)(VM)，探討Twist誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)在HCC血管生成中的作用，揭示HCC血管生成的可能分子機(jī)制。 方法：應(yīng)用CD31和PAS雙重染色及Hepatocyte免疫組化染色方法檢測(cè)102例福爾馬林固定、石蠟包埋肝細(xì)胞癌組織中是否存在血管生成擬態(tài)；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Twist、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、MMP-9和MMP-2在有VM組與

2、無(wú)VM組HCC中的表達(dá)，通過(guò)CD31免疫組化染色計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)。 結(jié)果：一、HCC中存在血管生成擬態(tài)：1.HE染色結(jié)果觀察到19例肝癌組織中存在由肝癌細(xì)胞圍成的管腔樣結(jié)構(gòu)，該管腔無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯附，管腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞，而管腔周?chē)匆?jiàn)壞死的肝癌細(xì)胞，也未見(jiàn)到出血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；還觀察到這種管腔樣結(jié)構(gòu)主要存在于分化差、惡性度高的實(shí)體型及低分化型的HCC中，提示這種結(jié)構(gòu)與HCC惡性生物學(xué)行為相關(guān)。2.CD31/PAS雙重染色及Hep

3、atocyte免疫組化染色結(jié)果CD31為內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)記物，而Hepatocyte為肝癌細(xì)胞特異標(biāo)記物，因此為了證實(shí)HE切片中觀察到的管腔樣結(jié)構(gòu)為血管生成擬態(tài)，本文進(jìn)行了CD31與PAS雙重染色及Hepatocyte免疫組化染色。顯微鏡下觀察顯示：圍成管腔樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞Hepatocyte染色陽(yáng)性、CD31染色陰性，證實(shí)為肝癌細(xì)胞而不是內(nèi)皮細(xì)胞，管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞，一層PAS陽(yáng)性物質(zhì)圍成環(huán)狀結(jié)構(gòu)將腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞分開(kāi)，管腔內(nèi)無(wú)壞死的腫瘤細(xì)胞

4、及炎細(xì)胞，提示該管腔樣結(jié)構(gòu)不是由于肝癌細(xì)胞壞死形成的裂隙，而是由肝癌細(xì)胞通過(guò)自身塑型圍成的類(lèi)似血管的管道，而PAS陽(yáng)性物質(zhì)圍成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)就類(lèi)似血管的基底膜，也即表明這種管道為VM；二、Twist及其相關(guān)蛋白免疫組化結(jié)果：1.Twist蛋白在HCC中的表達(dá)Twist彌漫表達(dá)于肝癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)，約有30％的病例陽(yáng)性細(xì)胞聚集呈局部高表達(dá)，有的癌巢中呈局灶性強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)：約有10％，尤其是低分化病例的肝癌細(xì)胞核內(nèi)也存在Twist的表達(dá)，提示Twi

5、st的定位與表達(dá)與肝癌細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)。存在VM的HCC組Twist陽(yáng)性表達(dá)率高，為78.95％(15/19)，陽(yáng)性強(qiáng)度亦高，其陽(yáng)性強(qiáng)度積分平均為2.94；而不存在VM的HCC組中Twist的陽(yáng)性表達(dá)率為42.17％(35/83)，其陽(yáng)性強(qiáng)度積分平均為2.62；兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Twist作為一種轉(zhuǎn)錄因子在VM形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可能起重要作用。2.上皮細(xì)胞粘附分子E-cadherin、β-caten

6、in在HCC中的表達(dá)E-cadherin主要表達(dá)于癌旁肝硬化組織的細(xì)胞膜上，呈現(xiàn)黃褐色顆粒狀著色，均勻分布。肝癌組織中E-cadherin表達(dá)降低甚至缺失。存在VM的HCC組E-cadherin的表達(dá)明顯降低，其陽(yáng)性表達(dá)率為15.79％(3/19)，而不存在VM的HCC組E-cadherin的表達(dá)陽(yáng)性率為48.19％(40/83)，兩者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，推測(cè)肝癌細(xì)胞之間粘附力的減弱可能是VM形成的一個(gè)重要因素。3.

7、間葉標(biāo)記蛋白Vimentin及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9在HCG中的表達(dá)Vimentin陽(yáng)性物質(zhì)分布于肝癌組織的間質(zhì)，主要位于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，而肝癌細(xì)胞均為陰性表達(dá)。Vimentin常特異性地表達(dá)于間葉細(xì)胞，但是上皮源性腫瘤在演進(jìn)過(guò)程中，也可“反常”表達(dá)，這種現(xiàn)象與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，提示肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為可能與Vimentin的表達(dá)無(wú)關(guān)。4.相關(guān)分析結(jié)果：Twist表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

8、(r=-0.227，P<0.05)，而與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.347，P<0.05)；三、Twist及其相關(guān)蛋白的表達(dá)與MVD的關(guān)系Twist高表達(dá)病例組MVD(20.48±13.52)大于低表達(dá)組(15.10±11.75)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MMP-2高表達(dá)病例組MVD(18.42±12.01)大于低表達(dá)組(12.52±10.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MMP-9高表達(dá)病例組MVD(20.0

9、8±13.36)大于低表達(dá)組(12.11±10.09)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；E-cadherin、β-catenin高表達(dá)組與低表達(dá)組之間MVD的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Twist、MMP-2和MMP-9可能促進(jìn)HCC內(nèi)皮依賴(lài)性血管的形成；四、Twist及其相關(guān)蛋白的表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系Twist、E-cadherin、β-catenin、MMP-2和MMP-9表達(dá)與HCC病人的年齡、性別、組織

10、學(xué)類(lèi)型、腫瘤大小以及Edmondson分級(jí)均不相關(guān)。Twist、E-cadherin、MMP-2和MMP-9的表達(dá)與HCC的臨床分期及轉(zhuǎn)移有關(guān)。Twist在臨床分期為IIIIV期的肝癌組織中陽(yáng)性率為60.71％(34/56)，與III期(陽(yáng)性率為34.78％)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率為75％(27/36)，而無(wú)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率為34.85％(23/66)，兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。E-c

11、adherin在臨床分期為IIIIV期的陽(yáng)性率為32.14％(18/56)，而在III期的陽(yáng)性率54.35％(25/46)，兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。E-cadherin在轉(zhuǎn)移組與無(wú)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率分別為27.78％(10/36)、50％(33/66)，兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MMP-2和MMP-9在轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性率分別為75％(27/36)、69.44％(25/36)，與無(wú)轉(zhuǎn)移組(陽(yáng)性率分別為42.1

12、2％、43.89％)相比都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明Twist的高表達(dá)、E-cadherin低表達(dá)可能加速了肝癌細(xì)胞的浸潤(rùn)進(jìn)展，MMP-2和MMP-9的高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解加速，從而使肝癌細(xì)胞易于移出癌巢和進(jìn)出血管，形成新的轉(zhuǎn)移灶。 結(jié)論：1)HCC中存在VM，VM是腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的一種獨(dú)特的血液供應(yīng)模式，與內(nèi)皮依賴(lài)性血管并存于腫瘤組織內(nèi)，其發(fā)生率為18.6％(19/102)，存在VM的HCC惡

13、性度高，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。2)存在VM的HCC組中Twist和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率均高于不存在VM的HCC組，而存在VM的HCC組中E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率低于不存在VM的HCC組；相關(guān)分析表明Twist陽(yáng)性表達(dá)與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與MMP-9呈正相關(guān)關(guān)系，提示Twist可能通過(guò)抑制E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)MMP-9的表達(dá)促進(jìn)HCC中VM的形成。MMP-9表達(dá)上調(diào)降解并重塑細(xì)胞外基質(zhì)，為肝癌細(xì)胞形成VM創(chuàng)造

14、了條件。3)MVD在Twist、MMP-9及MMP-2高表達(dá)組均大于低表達(dá)組；相關(guān)分析表明Twist陽(yáng)性表達(dá)與MMP-9呈正相關(guān)關(guān)系、而與MMP-2無(wú)相關(guān)關(guān)系，提示Twist可能主要通過(guò)上調(diào)MMP-9的表達(dá)促進(jìn)HCC血管生成，MMP-9通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，促進(jìn)HCC血管生成。4)Twist蛋白可能參與了HCC局部微循環(huán)的建立，其機(jī)制可能為T(mén)wist蛋白過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，使肝癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)下調(diào)，β-cate