跨膜絲氨酸蛋白酶4誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌血管生成的機(jī)制作用研究.pdf

1、目的:肝細(xì)胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是我國以及亞洲最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率與死亡率均居前列。肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究，對肝癌的臨床早期診斷、治療、降低術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移以改善肝癌患者預(yù)后具有重要的現(xiàn)實意義。研究表明，血管生成的程度與腫瘤的分期密切相關(guān)，抑制腫瘤血管生成在一定程度上可抑制腫瘤的進(jìn)展?？缒そz氨酸蛋白酶4(transmembraneserineprotease4，TMPRSS4)是Ⅱ型

2、跨膜絲氨酸蛋白酶(typeⅡtransmembraneserineprotease，TTSPs)家族中的重要一員，具有較為典型的絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)特征，研究已證實其可促進(jìn)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。前期研究表明，TMPRSS4可通過誘導(dǎo)肝癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移，但其對肝癌血管生成的影響及相關(guān)機(jī)制目前尚不清楚。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索TMPRSS4誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的血管生成的作用及其機(jī)制，為防治肝細(xì)胞癌提供新的治療靶點與

3、理論支持。
　　方法:
　　(1)采用人肝癌細(xì)胞株MHCC97H與HUH-7細(xì)胞系進(jìn)行實驗:本實驗采用肝癌細(xì)胞株MHCC97H與HUH-7細(xì)胞系。首先轉(zhuǎn)染TMPRSS4過表達(dá)的慢病毒，以構(gòu)建TMPRSS4上調(diào)的肝癌細(xì)胞株。根據(jù)實驗需要，我們將細(xì)胞分為:肝癌細(xì)胞的對照(control)組、空白載體轉(zhuǎn)染(Lv-GFP)組和TMPRSS4過表達(dá)(Lv-TMPRSS4)組。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立后，將兩種細(xì)胞株的control組、Lv-TM

4、PRSS4肝癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下成瘤。
　　(2)觀察指標(biāo)及方法:體外培養(yǎng)上述肝癌細(xì)胞株，Matrigel膠成管實驗檢測不同TMPRSS4表達(dá)肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)48h的細(xì)胞上清液對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（EA.hy926細(xì)胞）成管能力的影響;對皮下種瘤的腫瘤組織進(jìn)行CD34染色以判斷體內(nèi)條件下TMPRSS4作用于血管生成的能力;PCR檢測不同TMPRSS4表達(dá)的肝癌細(xì)胞株的血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowt

5、hfactor，VEGF)的表達(dá)量，WesternBlot檢測哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)以及磷酸化mTOR的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　(1)TMPRSS4過表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建
　　TMPRSS4過表達(dá)慢病毒載體、空白載體轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株MHCC97H、HUH-7細(xì)胞株48h后，在熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染空白載體的(Lv-GFP)及TMPRSS4過表達(dá)慢病毒載體(Lv

6、-TMPRSS4)的肝癌細(xì)胞均帶有綠色熒光，未轉(zhuǎn)染慢病毒載體的對照組細(xì)胞在熒光顯微鏡下未見綠色熒光。qRT-PCR、WesternBlot結(jié)果顯示慢病毒載體轉(zhuǎn)染48h后，轉(zhuǎn)染TMPRSS4過表達(dá)載體的肝癌細(xì)胞TMPRSS4的表達(dá)水平顯著增高。說明人肝癌TMPRSS4過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。
　　(2)TMPRSS4促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管擬態(tài)形成
　　Matrigel膠成管實驗顯示，加入TMPRSS4過表達(dá)肝癌細(xì)胞細(xì)胞上清培養(yǎng)液后，人

7、臍靜脈細(xì)胞在基質(zhì)膠中的成管能力顯著高于對照組及空白載體組。這表明TMPRSS4分泌了促腫瘤血管生成因子，從而促進(jìn)了臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠中的血管擬態(tài)形成。
　　(3)體內(nèi)實驗證實TMPRSS4可誘導(dǎo)肝癌血管生成
　　免疫組化結(jié)果顯示，TMPRSS4過表達(dá)的HUH-7細(xì)胞所形成的腫瘤組織中TMPRSS4表達(dá)顯著增強(qiáng)。CD34結(jié)果顯示TMPRSS4過表達(dá)組腫瘤組織的微血管密度(microvesseldenisity，MVD)顯著

8、高于對照組。這說明在體內(nèi)條件下，TMPRSS4可促進(jìn)肝細(xì)胞癌微血管形成。
　　(4)TMPRSS4可促進(jìn)肝癌細(xì)胞分泌VEGF
　　qRT-PCR結(jié)果顯示:Lv-TMPRSS4過表達(dá)組的VEGF表達(dá)量顯著高于對照組及轉(zhuǎn)染空白載體組。
　　(5)TMPRSS4可促進(jìn)肝癌細(xì)胞內(nèi)的p-mTOR表達(dá)
　　WesternBlot結(jié)果顯示，Lv-TMPRSS4過表達(dá)組的p-mTOR表達(dá)量顯著高于對照組及轉(zhuǎn)染空白載體組，總mTO