副豬嗜血桿菌細胞致死膨脹毒素和假定絲氨酸蛋白酶EspPs的致病作用研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬上呼吸道常在條件致病菌，在宿主免疫力低下時引發(fā)格拉瑟氏病，主要剖檢病變是:多發(fā)性漿液性纖維素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。近年來該病的發(fā)生導致全球范圍養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟損失。為了有針對性地制定出高效的綜合防治策略必須對該菌的分子致病機理進行剖析闡釋。
　　 本研究以HPS細胞膨脹致死毒素(Cytolethal distending toxin，CDT)

2、和假定的絲氨酸蛋白酶EspPs(包括EspP1和EspP2)為研究對象。它們都是HPS中已有報道的潛在的致病因子。以往對細胞膨脹致死毒素的研究多采用體外分析的方法，而體內(nèi)研究的報道較少，而且在HPS中也沒有CDT導致細胞凋亡的報道。IgA蛋白酶在逃避宿主天然免疫中發(fā)揮著重要作用，曾在流感嗜血桿菌等細菌中有報道，最近發(fā)現(xiàn)某些HPS菌株的分泌蛋白有IgA蛋白酶活性，但是還沒有在HPS中發(fā)現(xiàn)和流感嗜血桿菌的IgA蛋白酶同源的基因，蛋白結(jié)構(gòu)分析

3、和基因序列分析發(fā)現(xiàn)HPS菌株SH0165中的假定的絲氨酸蛋白酶EspPs有可能是IgA蛋白酶。本研究主要取得的研究結(jié)果如下:
　　 1.構(gòu)建cdt基因缺失突變株并研究CDT對細胞和豚鼠的致病作用
　　 1.1自然轉(zhuǎn)化法篩選得到cdt基因缺失突變株
　　 本研究用自然轉(zhuǎn)化法在HPS血清4型野生菌株JS0135中篩選到3個cdt基因缺失突變株，包括JS0135△cdt1、JS0135△cdt2和JS0135△cdt1

4、△cdt2。突變株的構(gòu)建過程首先要構(gòu)建質(zhì)粒pK18-C1G和pK18-C2K，然后通過自然轉(zhuǎn)化分別把這兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到實驗室保存的標準菌株和野生菌株中，篩選出能共同轉(zhuǎn)化這兩個質(zhì)粒的菌株JS0135（經(jīng)測序，這個菌株基因組上的cdt也是雙拷貝而且和SH0165基因組上的cdt序列相同），經(jīng)過抗性平皿的篩選，PCR、Western blot、Southern blot等方法的鑒定，這兩個質(zhì)粒上的慶大霉素抗性盒和卡那霉素抗性盒分別等位替換了JS

5、0135基因組上的cdt1和cdt2。cdt的3個缺失突變株構(gòu)建成功。
　　 1.2 HPS的CDT引起PK15細胞的形態(tài)學變化但不引起PK15細胞凋亡我們用了三種不同的方法，分別是流式細胞術(shù)，DNA ladder和細胞核熒光染色技術(shù)來檢測野生菌株的分泌蛋白和cdt基因缺失株的分泌蛋白對細胞凋亡的影響。希望通過野生株和缺失株對細胞作用的對比來分析HPS的CDT對細胞凋亡的影響。三種不同的方法中，流式細胞術(shù)的結(jié)果說明CDT能引起細

6、胞在培養(yǎng)48～72h時死亡，這個過程較為迅速，凋亡細胞比例較小;DNA ladder沒有出現(xiàn)明顯的基因碎裂帶，這一結(jié)果說明CDT沒有引起明顯的PK15凋亡;細胞核熒光染色只能看到細胞核膨脹但是沒有典型的凋亡細胞核特征——核碎裂現(xiàn)象。以上3種方法共同說明CDT引起PK15細胞膨脹死亡，但是不引起PK15細胞凋亡。
　　 另外，我們將野生菌株和cdt基因缺失株的分泌蛋白和菌體蛋白分別作用于PK15細胞，發(fā)現(xiàn)野生菌株的分泌蛋白和菌體蛋

7、白引起細胞核明顯增大，比對照組大3～4倍，細胞大小不均一，數(shù)量減少，細胞核周圍存在大量空泡，部分細胞核致密濃染，而基因缺失株則不能，說明HPS的CDT能引起PK15細胞的形態(tài)學變化。
　　 1.3 HPS的CDT對豚鼠的致病作用
　　 以MLD劑量對2組豚鼠分別腹腔注射野生菌株JS0135及其cdt缺失突變菌株JS0135△cdt1△cdt2，注射后連續(xù)觀察7天發(fā)現(xiàn)，(1)與野生菌株相比，cdt基因缺失株致豚鼠死亡率較低

8、，表明CDT與HPS的毒力相關(guān);(2)野生菌株能引起豚鼠內(nèi)臟器官的病變，主要有肺部充血，大腦充血，胸水腹水增多;(3)在野生菌株感染致死的豚鼠胸水中分離到HPS而cdt基因缺失株感染的豚鼠各臟器未分離到HPS，說明CDT與細菌的侵襲力相關(guān)或與抵抗宿主免疫的能力相關(guān)。
　　 2.假定的絲氨酸蛋白酶EspP1、EspP2具有IgA蛋白酶活性
　　 用血清5型野生菌株CF7066及其3個espP缺失株（CF7066△espP1