副豬嗜血桿菌細胞致死膨脹毒素細胞毒性機制研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，H.parasuis）是引起副豬嗜血桿菌病的病原，該病主要表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎及腦膜炎。細胞致死膨脹毒素(Cytolethal distending toxin，CDT)是H.parasuis的重要毒力因子，由CdtA、 CdtB和CdtC3個亞基組成。為研究副豬嗜血桿菌細胞致死膨脹毒素(HpCDT)對宿主細胞的毒性作用，本研究以豬肺泡巨噬細胞(PAM)和PK-15細胞為模型

2、，運用流式細胞術(shù)、激光共聚焦、免疫印跡、熒光定量PCR等方法進行毒素與細胞的互作研究。
　　通過Predsi、Signal-Blast和Signal-3L軟件預(yù)測CdtA，CdtB和CdtC的信號肽，結(jié)果顯示其信號肽分別為N端1-19aa、1-21aa和1-19aa。去掉信號肽后成功地以可溶形式表達了3種重組蛋白。純化的CdtB在體外能夠剪切環(huán)狀或線性DNA，表明其具有DNase活性;在體內(nèi)純化的CdtB能夠誘導(dǎo)PK-15細胞產(chǎn)生

3、γ-H2A.X，說明其具有DNase活性，并引起了DNA雙鏈斷裂。經(jīng)流式細胞儀分析重組蛋白處理的細胞周期和凋亡情況，結(jié)果表明單獨的CdtB能夠引起PAM和PK-15細胞G2/M期阻滯和細胞凋亡，而在CdtA或/和CdtC的幫助下能夠更顯著地增強這種作用。進一步研究結(jié)果表明CDT全毒素能夠引起最顯著的細胞膨脹、細胞周期阻滯和細胞凋亡。Pifithrin-α和CDT共同處理PK-15細胞能夠明顯地抑制其細胞凋亡，說明CDT誘導(dǎo)的凋亡是p53