Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶HATL4的表達(dá)及其單克隆抗體的研制.pdf

1、目的：II型跨膜絲氨酸蛋白酶（Type II Transmembrane Serine Proteases，TTSPs）是一類通過氨基末端跨膜區(qū)域錨定在細(xì)胞膜上的絲氨酸蛋白酶，在哺乳動(dòng)物的許多生物學(xué)過程中扮演著重要角色，其功能異常可導(dǎo)致癌癥、缺鐵性貧血、耳聾、心血管疾病等。在人類，TTSPs共有17個(gè)成員，其中人呼吸道胰蛋白酶樣蛋白酶（Human airway trypsin-like protease，HAT）最早發(fā)現(xiàn)存在于慢性呼吸道

2、疾病患者的痰液中，在粘液生成、水解流感病毒的血凝素抗原以及細(xì)胞遷移和基底膜的降解中起到關(guān)鍵性的作用。HATL4蛋白酶為TTSPs中HAT/DESC亞家族中的一個(gè)成員，目前國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)HATL4蛋白酶生物學(xué)功能的任何報(bào)道，對(duì)它的生物學(xué)活性和功能知之甚少。本研究首先探討HATL4在人惡性血液病細(xì)胞系和白血病患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)；然后表達(dá)、純化重組HATL4，免疫小鼠，研制抗人HATL4單克隆抗體；并運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)

3、方法對(duì)所制備的抗體進(jìn)行驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究HATL4的生物學(xué)功能提供工具。
　　方法：
　?。?）利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)HATL4在人惡性血液病細(xì)胞系和白血病患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)；
　　（2）利用RT-PCR從人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞系MEG-01中擴(kuò)增編碼HATL4蛋白的蛋白酶活性區(qū)域片段，與克隆載體pMD18-T simple連接，經(jīng)Sac I、Hind III雙酶切鑒定后送測(cè)序，然后定向插入原核表達(dá)

4、載體pQE30，并在原核表達(dá)菌株M15中實(shí)現(xiàn)重組蛋白6?His-HATL4的表達(dá)；
　　（3）利用鎳離子親和層析法純化融合蛋白，并對(duì)純化產(chǎn)物復(fù)性和濃縮；用Western blotting分析純化產(chǎn)物；
　　（4）以純化的HATL4融合蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與同種系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。采用ELISA方法，用純化的重組HATL4融合蛋白篩選只與HATL4反

5、應(yīng)的能持續(xù)分泌抗人 HATL4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。通過 Protein-G親和層析柱純化腹水， SDS-PAGE分析純化結(jié)果。
　?。?）HATL4真核表達(dá)載體的構(gòu)建：采用RT-PCR技術(shù)從人成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞系（MEG-01）中擴(kuò)增HATL4基因cDNA全長(zhǎng)基因片段，經(jīng)過酶切鑒定后，克隆至pcDNATM3.1/V5-HisTOPO TA載體，測(cè)序鑒定。
　?。?）HATL4在CHO細(xì)胞的表達(dá)：根據(jù)Fermentas

6、轉(zhuǎn)染試劑說明書，將HATL4真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO），用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。
　　（7）HATL4抗體的鑒定：流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)所制備的抗體進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：
　?。?）采用RT-PCR技術(shù)對(duì)18種人惡性血液病細(xì)胞系和81例惡性血液病患者骨髓細(xì)胞中HATL4 mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HATL4 mRNA在急性髓細(xì)胞白血?。ˋcute Myelocytic Leu

7、kemia，AML）患者骨髓細(xì)胞中表達(dá)特異性增高。
　　（2）構(gòu)建了 HATL4原核表達(dá)質(zhì)粒，并在 M15中成功表達(dá) HATL4融合蛋白；SDS-PAGE顯示該融合蛋白分子量約26 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符；融合蛋白以包涵體形式存在，表達(dá)產(chǎn)量約占菌體總蛋白60%；經(jīng)純化、復(fù)性后的融合蛋白純度>95%，Western blotting結(jié)果顯示一條his抗體特異性識(shí)別的蛋白條帶。
　?。?）成功獲得分泌穩(wěn)定的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株

8、5株，分別命名為2E6、2D7、2H10、3C10、6D3。經(jīng)過Protein-G親和層析柱純化后的5株單克隆抗體分別在還原劑與非還原劑條件下進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色。非還原條件下可見一條150 kDa的條帶，還原條件下可見分子量55 kDa的重鏈和25 kDa的輕鏈。
　?。?）成功構(gòu)建含有HATL4全長(zhǎng)cDNA的真核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示，V5抗體能檢測(cè)到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞裂解液中的約5

9、0 kDa的HATL4蛋白條帶。
　　（5）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明5株單抗均能特異性識(shí)別 CHO細(xì)胞中表達(dá)的重組HATL4。在白血病細(xì)胞株中，也檢測(cè)到HATL4在MEG-01中表達(dá)率高達(dá)85.7%，在K562及KU-812中表達(dá)較弱，分別為4.7%和19.7%，而在NB4中幾乎沒有表達(dá)，只有1.23%。免疫熒光發(fā)現(xiàn)我們研制的抗體能特異性識(shí)別HATL4，并發(fā)現(xiàn)HATL4定位于腫瘤細(xì)胞膜表面。
　　結(jié)論：本研究首次發(fā)現(xiàn)HATL4在急