己烯雌酚單克隆抗體和酶標抗原的研制.pdf

1、己烯雌酚(diethylstibestrol，DES)是一種人工合成的雌激素，在促進動物蛋白質(zhì)的合成代謝、提高動物日增重和減少脂肪等方面效果明顯，因此一直被作為一種動物生長促進劑用于畜禽以及水產(chǎn)品養(yǎng)殖中。國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)研究發(fā)現(xiàn)，DES是一種致癌物質(zhì)，能夠在動物源性食品如肝臟、肌肉、蛋、奶中殘留，并通過食物鏈危害人體健康。因此世界各國均規(guī)定食品動物養(yǎng)殖中不得以任何途徑和方式使用DES，養(yǎng)殖動物及動物性食品中不得檢出DES。

2、 DES殘留免疫分析是DES應(yīng)用監(jiān)控的一種重要手段，本文通過DES人工抗原的制備和鑒定、抗DES多克隆和單克隆抗體的制備和鑒定、DES酶標抗原合成以及酶免疫檢測DES方法的建立等研究，旨在研制DES酶免疫檢測試劑盒。 對己烯雌酚進行了結(jié)構(gòu)修飾，用有機合成方法合成了DES單羧甲基醚，并通過紅外、質(zhì)譜和核磁共振氫譜鑒定合成成功；通過混合酸酐法和碳二亞胺法分別將DES單羧甲基醚與大分子蛋白質(zhì)載體牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清蛋白

3、(OVA)偶聯(lián)，合成了四種人工抗原，并通過紫外掃描和SDS-PAGE凝膠電泳鑒定偶聯(lián)成功，其中BSA與DES的偶聯(lián)率約為1∶30，OVA與DES的偶聯(lián)率為1∶18。 用混合酸酐法合成的BSA-DES免疫4只家兔，用混合酸酐法合成的OVA-DES和碳二亞胺法合成的OVA-DES免疫兩組小鼠，獲得了3種抗血清，選用不同的包被原，通過間接ELISA和間接阻斷ELISA法對3種抗血清進行了鑒定，兔血清抗體效價在1∶10000以上，小鼠血

4、清抗體效價在1∶8000以上，三種抗血清都能和DES特異性結(jié)合，同時建立了ELISA檢測方法。 選用混合酸酐法合成的BSA-DES免疫Balb/c小鼠，用碳二亞胺法合成的OVA-DES做包被檢測原，間接ELISA檢測小鼠血清效價均在1∶1×105以上，選擇其中效價最高的兩只小鼠脾細胞，在PEG的作用下與SP2/0瘤細胞融合，通過間接ELISA法檢測了單抗雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中的抗體效價達1∶400以上，同時建立了DES殘留檢測的酶

5、免疫檢測方法，其中檢測限達0.2μg/Kg。 用碳二亞胺法合成了酶標抗原HRP-DES，通過ELISA法證明了HRP-DES的正確合成。同時，建立了固相抗體競爭ELISA法檢測DES殘留，并繪制了檢測曲線。 本研究首先將DES衍生成DES單羧甲基醚，通過兩種偶聯(lián)方法和兩種載體合成了四種不同的人工抗原，通過兔子和小鼠的免疫試驗，成功制備了高效價特異性DES抗血清和單克隆抗體，建立了DES殘留檢測的競爭ELISA方法，同時成