已烯雌酚和雙烯雌酚單克隆抗體的制備及ELISA方法的研究.pdf

1、己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)和雙烯雌酚(Dienestrol,DIEN)是人工合成的非甾體雌激素,由于具有促進(jìn)蛋白沉積、提高動(dòng)物日增重和減少脂肪合成等作用,曾經(jīng)一度作為促生長劑廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。隨著其致畸致癌等毒副作用廣泛被人們所認(rèn)識,許多國家和地區(qū)先后頒布禁令,禁止其應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)。由于受到經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使,違法使用的現(xiàn)象依然存在。為了有效地監(jiān)控動(dòng)物性食品中的DES和DIEN殘留,建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確

2、、靈敏的檢測方法勢在必行。本研究旨在分別制備抗DES和抗DIEN的單克隆抗體,建立DES和DIEN殘留檢測的ELISA方法。
　　 1.活化DES和DIEN。針對DES合成了3種半抗原:己烯雌酚.單羧基丙基醚(DES-CP)、已烯雌酚-半琥珀酸(DES-HS)和己烯雌酚-單羧基甲基醚(DES-CM),其中,DES-CP通過活潑酯法與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)作為免疫原,DES-CP、DES-HS和DES-CM與卵清蛋白(OVA)

3、偶聯(lián)作為包被原。針對DIEN合成了2種半抗原:雙烯雌酚-單羧基丙基醚(DIEN-CP)和雙烯雌酚-半琥珀酸(DIEN-HS),其中,DIEN-CP與BSA偶聯(lián)作為免疫原,DIEN-HS與OVA偶聯(lián)作為包被原?？乖?jīng)紫外掃描圖譜鑒定,DES和DIEN分別與載體蛋白偶聯(lián)成功。免疫原經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定,DES和DIEN與BSA偶聯(lián)比分別為12:1和11:1。
　　 2.為了研究間隔臂對

4、ELISA靈敏度的影響,設(shè)計(jì)了上述3種不同空間結(jié)構(gòu)間隔臂的包被原(DES—CA-OVA、DES-CP-OVA、DES-HS-OVA)測定抗血清。將DES免疫原免疫新西蘭白兔,獲得了抗DES的多克隆抗體。結(jié)果表明4個(gè)碳鏈間隔臂異源結(jié)構(gòu)的包被原(DES-HS—OVA)建立ELISA的靈敏度最高。以此包被原建立間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,DES在1～30ng／ml呈線性關(guān)系,IC50為7.0ng／ml。同時(shí),抗DES多抗成功的獲得也為制備單克

5、隆抗體打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 3.為了制備DES和DIEN單克隆抗體,將DES和DIEN免疫原免疫BALB／c小鼠,經(jīng)融合、選擇性培養(yǎng)、篩選、克隆等步驟,獲得了3株穩(wěn)定分泌抗DES抗體的細(xì)胞株,分別命名為389、8F10和9C1；2株穩(wěn)定分泌抗DIEN抗體的細(xì)胞株,分別命名為7H8和10D10。將細(xì)胞注入BABL／c小鼠腹腔生產(chǎn)腹水,硫酸胺純化,SDS-PAGE電泳鑒定。間接ELISA測定抗DES和DIEN單克隆抗體效價(jià)都達(dá)到

6、1:1.0×106。單抗亞類試劑盒測定,分泌的單抗都屬于IgG1,Kappa型。
　　 4.以抗DES和抗DIEN單克隆抗體為基礎(chǔ),分別優(yōu)化了包被原和抗體工作濃度、包被條件、封閉時(shí)間、抗體反應(yīng)時(shí)間、緩沖液pH、離子強(qiáng)度等條件,建立了DES和DIEN間接競爭ELISA方法,其中DES在0.3～3ng／ml呈線性關(guān)系,IC50為1.0ng／ml,檢測限(LDD)為0.065ng／ml,定量限(LOQ)為0.15ng／ml,與己烷雌酚

7、(HEX)和DIEN的交叉反應(yīng)為7.7％和1.3％,與17β-雌二醇無交叉反應(yīng)。DIEN在1～30 ng／ml呈線性關(guān)系,IC50為5.4ng／ml,LOD為0.16ng／ml,LOQ為0.24ng／ml,與HEX、DIEN和17β-雌二醇均無交叉反應(yīng)。
　　 5.將DES和DIEN分別添加至雞肉中進(jìn)行回收率測定,結(jié)果顯示DES回收率為71％～107％,DIEN的回收率為62％～64％。以此方法測定了隨機(jī)采集的16份雞肉樣本,結(jié)