己烷雌酚抗體的制備與ELISA方法的建立.pdf

1、動物性食品的安全問題已成為社會各界極為關(guān)注的食品安全熱點問題。己烷雌酚殘留因為其潛在的致癌性以及其它不良作用對人類的健康造成極大的威脅。本論文旨在研究快速檢測己烷雌酚(Hexoestrol，HES)的ELISA試劑盒，這對食品安全監(jiān)督以及技術(shù)儲備都有重要的意義。 本課題首先對HES進(jìn)行衍生化，然后用混合酸酐法分別與牛血清白蛋白(Bovme serum albumin，BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)以及辣根過氧

2、化物酶(Horeradish peroxidase，HRP)交聯(lián)，制備成免疫抗原HES-BSA、包被抗原HES-OVA和酶標(biāo)抗原HES-HRP。通過紫外分光光度法鑒定其合成并估算HES-BSA和HES-OVA的交聯(lián)率分別為17.9和13.2。用免疫原HES-BSA免疫新西蘭白兔制備抗血清，產(chǎn)生的抗血清效價最高達(dá)到160000．然后以此抗體為基礎(chǔ)設(shè)計了間接競爭ELISA方法以及直接競爭ELISA法，并優(yōu)化了包被時間、pH、競爭時間等實驗條

3、件。優(yōu)化后的間接法和直接法的檢測限分別達(dá)到0.05ng/mL和0.04ng/mL，50％的抑制率(50％inhibitory concentration，IC<,50>)分別為0.67ng/mL和0.53ng/mL。直接法總耗時只需大約1.6h，間接法則需要4.65h。用己烯雌酚、雙烯雌酚以及激素類藥物19-去甲基睪酮、孕酮、睪酮、雌酮來檢測此方法的特異性，除了己烯雌酚以及雙烯雌酚的交叉率較高之外(間接法中分別為25％和6％，直接法分別

4、為0.5％和0.3％)，其余的均小于0.1％。對豬肉、牛肉、魚肉作了1ng/g和5ng/g水平的添加回收實驗，兩種方法的回收率分別為68-108％和35-102％，變異系數(shù)(Coefficient of variation，c．V)均在16％以下。采用與儀器分析相比較的方法來對方法進(jìn)行準(zhǔn)確性研究，結(jié)果較為一致。本文還對試劑盒的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，間接法中低溫3個月以及37℃保存6天的實驗驗證了試劑盒的穩(wěn)定性。直接法中，試劑盒在一個月的冷藏