抗Citrulline-Carbamylation抗體的制備及其ELISA檢測方法的初步建立.pdf

1、在mRNA翻譯成為蛋白質(zhì)之后，有時(shí)會共價(jià)修飾某些蛋白質(zhì)上的特定氨基酸殘基，該過程被稱為蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTM)。其中磷酸化、糖基化、瓜氨酸化、糖化、羥基化和泛素化較為常見。不同的修飾方式涉及不同的氨基酸，存在于不同的疾病生理病理過程，它們常常伴隨多種自身免疫性疾病(AID)的發(fā)生。
　　瓜氨酸化(Citrullination)是一種酶介導(dǎo)的PTM方式。它是在Ca2+的參與和肽酰基精氨酸脫亞氨酶(PAD)催化作用下把精氨酸(Arg

2、)殘基的胍基轉(zhuǎn)變成脲基，生成瓜氨酸(Cit)殘基。以前通常認(rèn)為瓜氨酸化是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）所特異的。但是隨著研究地不斷深入，在牛皮癬、多發(fā)性硬化癥、纖維化、老年癡呆癥和腫瘤等疾病中也發(fā)現(xiàn)了瓜氨酸化。
　　氨甲?；?Carbamylation/Homocitrullination)的具體過程是蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基在尿素的衍生物—氰酸酯的作用下轉(zhuǎn)變成高瓜氨酸(Hcit)殘基，常存在于尿毒癥、腎衰竭、動脈粥樣硬化和冠狀動脈疾病等癥狀中

3、。
　　本文展開了對瓜氨酸化和氨甲?；难芯?，半抗原的設(shè)計(jì)與合成，制備抗Citrulline抗體和抗Carbamylation抗體，著力于ELISA檢測方法的建立。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）Citrulline半抗原的設(shè)計(jì)借鑒了氨基脲（SEM）、呋喃唑酮代謝物（AOZ）、福美雙（Thiram）和磷酸化酪氨酸半抗原設(shè)計(jì)的方法，增加了半抗原的復(fù)雜性，設(shè)計(jì)并合成了Citrulline人工抗原。同時(shí)參照文獻(xiàn)也合成了Carbamy

4、lation人工抗原。BCA法測定了5個(gè)免疫原和3個(gè)包被原的濃度，SDS-PAGE法鑒定了人工抗原。
　?。?）免疫大白兔和小鼠后，檢測到了抗Citrulline抗體和抗Carbamylation抗體?？笴it-G-BSA兔子抗血清效價(jià)效價(jià)均大于3.2×104，抗體特性同商品化的多抗?？筩BSA/cKLH小鼠抗血清效價(jià)效價(jià)均大于6.4×104。
　?。?）取目的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)3輪細(xì)胞亞克隆操作后，建立

5、起了4個(gè)抗氨甲?；鞍准?xì)胞株，分別命名為13C11-F12-H2-F4、14E5-E8-G3-D8、14E10-F6-F7-E5和10E3-F9-G5-D8。
　?。?）通過動物體內(nèi)誘生法和蛋白A親和層析獲得了2個(gè)抗Carbamylation單克隆抗體，命名為mAb-13C11和mAb-10E3，效價(jià)均大于3.14×106，亞類均為IgG2b，都特異性地識別氨甲酰化的蛋白質(zhì)，不識別正常蛋白。
　?。?）引入雙抗夾心法和生物素

6、-親和素系統(tǒng)，利用mAb-13C11建立起了ELISA檢測方法，確定最佳條件為：mAb-13C1120μg/mL、1％BSA、Bio-13C113μg/mL、SA-HRP12.5ng/mL和TMB20min。對氨甲酰化蛋白的檢測已達(dá)到ng級別。成功地檢測到冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、動脈粥樣硬化心肌梗塞和關(guān)節(jié)炎病人滑液疾病樣本中氨甲?；鞍椎暮颗c對照組有顯著差異。
　　本文初步探索了citrulline半抗原的設(shè)計(jì)，同時(shí)為氨甲?；?/p>