抗豬γ干擾素單克隆抗體的制備及定量抗原捕獲elisa檢測(cè)方法的初步建立

1、碩士研究生論文答辯,抗豬γ-干擾素單克隆抗體的制備及定量抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的初步建立,報(bào)告內(nèi)容,研究背景研究思路與策略試驗(yàn)方法及結(jié)果討論小結(jié)與展望研究成果,研究背景,?-干擾素（IFN-?）是機(jī)體內(nèi)具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能的重要細(xì)胞因子。它主要由激活的T細(xì)胞、激活的NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。 豬IFN-?全基因編碼166個(gè)氨基酸殘基，包括20aa的信號(hào)肽(Dijkmans,1990)。信號(hào)肽切除后，

2、產(chǎn)生146aa的IFN-?單體，分子量為17.3kD，天然活性狀態(tài)的IFN-?是由兩個(gè)IFN-?單體經(jīng)非共價(jià)交聯(lián)形成的同源二聚體糖蛋白(Boehm,1997)。,?-干擾素概述,IFN-γ的細(xì)胞分泌機(jī)制,MHC II+抗原遞呈細(xì)胞將抗原肽遞呈給CD4+T細(xì)胞,使幼稚CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有IFN-γ分泌功能和增殖能力的效應(yīng)Th細(xì)胞。 MHC I+抗原遞呈細(xì)胞將抗原肽遞呈給CD8+T細(xì)胞，使后者轉(zhuǎn)化為具有IFN-γ分

3、泌功能和增殖能力、靶細(xì)胞殺傷功能的效應(yīng)CTL細(xì)胞。 NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被病原體所攜帶的LPS激活后，亦能分泌IFN-γ。,T 細(xì)胞,IFN-?檢測(cè)的免疫學(xué)意義,機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)藥物的療效評(píng)估細(xì)胞免疫功能分析病原體T細(xì)胞表位鑒定,IFN-γ的免疫學(xué)檢測(cè)方法,抗原捕獲ELISA酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR,ELISPOT 原理,,Y Y Y Y

4、Y Y Y Y Y Y Y Y Y,,,,,,,,,,,,Y抗IFN-γ單抗,,,,卵黃抗體的免疫學(xué)特性,對(duì)細(xì)菌及哺乳動(dòng)物蛋白抗原具有很高的親和力 不與細(xì)菌或哺乳動(dòng)物Fc受體結(jié)合，因而不能激活補(bǔ)體系統(tǒng) 不與哺乳動(dòng)物血清中的類風(fēng)濕因子反應(yīng)，與哺乳動(dòng)物IgG和IgM沒有交差反應(yīng) 疏水性比IgG強(qiáng)，因而更容易包被于ELISA板和乳膠微球表面 穩(wěn)定性好,生物素-親和素系統(tǒng),生物素-親和素系統(tǒng)是70年代末期發(fā)展起來的一種新

5、型生物放大系統(tǒng)，其具有以下幾個(gè)顯著特點(diǎn)： 高靈敏度：由于每個(gè)親和素分子可結(jié)合4個(gè)生物素分子，其結(jié)合常數(shù)高達(dá)1015mol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抗原抗體的結(jié)合常數(shù)（105-11mol/L），因而該系統(tǒng)具有放大作用，能顯著提高檢測(cè)的靈敏度。 高特異性：親和素和生物素的結(jié)合反應(yīng)很強(qiáng)，并具有高度專一性。加上系統(tǒng)的高靈敏性，因而使試劑經(jīng)得起高倍稀釋，從而大大減少了通常免疫反應(yīng)中出現(xiàn)的非特異性作用。 高穩(wěn)定性 ：親和素與生物素一旦結(jié)合就很難解離

6、，酸、堿、有機(jī)試劑、蛋白酶等均不影響二者的結(jié)合作用。,本試驗(yàn)研究目的和意義,本研究旨在應(yīng)用生物素-親和素放大系統(tǒng)，以單克隆抗體和卵黃抗體為基礎(chǔ), 建立一套檢測(cè)豬IFN-?的定量抗原捕獲ELISA方法，為進(jìn)一步建立豬IFN-?的ELISPOT檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。,研究思路與策略,,,研究報(bào)告,將在大腸埃希氏菌中表達(dá)的重組豬?-干擾素（rpIFN-?）免疫8周齡BALB/c鼠3次后，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按標(biāo)準(zhǔn)程序融合后，用表達(dá)的重組

7、豬?-干擾素和豬?-干擾素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行交叉篩選，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗豬IFN-?單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株 。利用Western-blot分析和間接免疫熒光分析對(duì)該株單克隆抗體進(jìn)行特異性鑒定。,抗豬?-干擾素單克隆抗體的制備,單抗的Western-blot鑒定,1.預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas) ; 2.重組豬IFN-γ 3.豬IFN-γ 標(biāo)準(zhǔn)品（R&D systems) ; 4. BSA,本單克隆抗體能夠被豬IFN

8、-γ 標(biāo)準(zhǔn)品所識(shí)別,單抗的間接免疫熒光（IFA）分析,,A：PMA刺激PBMC；B：未刺激PBMC,本單克隆抗體能夠被天然IFN-? 所識(shí)別,分離豬PBMC,,PMA誘導(dǎo),,單抗孵育,,熒光二抗,卵黃抗體效價(jià)測(cè)定,,高滴度抗體出現(xiàn)時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),抗原特異性IgY的純化,,SDS-PAGE,薄層掃描分析,1. 預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)2. (NH4)2SO4粗提IgY3. 免疫親和純化的IgY,卵黃分離,,,氯仿脫脂,,硫酸氨粗提,,親

9、和純化,,抗原特異性IgY的產(chǎn)率為0.26mg/mL卵黃液,生物素標(biāo)記的卵黃抗體的制備,生物素標(biāo)記的卵黃抗體的洗脫曲線,抗體透析,,生物素標(biāo)記,,抗體脫鹽,,HABA分析,平均每個(gè)IgY分子標(biāo)記4.37個(gè)生物素分子,生物素標(biāo)記卵黃抗體的效價(jià),,注：a.抗體起始濃度為500ng/ml；b.陰性對(duì)照為相同濃度的非標(biāo)記卵黃抗體； c.OD490nm>4.0,生物素標(biāo)記的卵黃抗體具有良好的生物活性和較高的抗體滴度,抗豬IFN-?

10、單克隆抗體的純化,薄層掃描分析,1.蛋白Marker；2. 小鼠腹水；3. 免疫親和純化的單克隆抗體,SDS-PAGE,親和層析法純化的單克隆抗體純度為95.1%,與A/G蛋白層析純化的抗體純度相當(dāng),單克隆抗體包被濃度的選擇,,通過單抗抗包被濃度-被檢物濃度方陣試驗(yàn)，確定單克隆抗體的最佳包被濃度 為8ug/mL,生物素標(biāo)記卵黃抗體工作濃度的選擇,,固定包被抗體的濃度(8ug/mL ),通過生物素標(biāo)記卵黃抗體濃度-- 被檢物濃度方陣試驗(yàn)

11、，確定生物素標(biāo)記卵黃抗體的最佳稀釋倍數(shù)為2000,即工作濃度 為0.25ug/mL,封閉劑的選擇,,采用捕獲抗體及檢測(cè)抗體的最佳工作濃度，比較不同封閉劑的封閉效果，采用1%Casein-PBS作封閉劑，其背景最低，信噪比最高。,rpIFN-?檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線,以本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化好的ELISA反應(yīng)條件，繪制OD450值--rpIFN-?抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。,被檢抗原濃度在7.8-1000ng/mL范圍內(nèi)能形成一條近似線性曲線。,靈敏度的確定,,,用稀

12、釋液作為空白對(duì)照，共設(shè)24個(gè)重復(fù)。則檢測(cè)靈敏度為（OD450平均值+2SD）在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對(duì)應(yīng)的rpIFN-?濃度 。,24個(gè)空白對(duì)照的OD450平均值為0.058，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0041，則 （OD450平均值+2SD）值為0.066，其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線上rpIFN-?的濃度為7.8ng/mL,特異性試驗(yàn)（一）,目前只對(duì)商品化人IFN-γ 樣品進(jìn)行了特異性試驗(yàn)。應(yīng)用本系統(tǒng)檢測(cè)106IU/mL的該樣品的OD450平均值為0.086，而陰性對(duì)

13、照的平均值為0.059，因而可判定為無交叉反應(yīng)。,特異性試驗(yàn)（二）,應(yīng)用本試實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)系統(tǒng)和商品化的檢測(cè)小鼠IFN-?的ELISPOT試劑盒檢測(cè)經(jīng)系列稀釋的ConA樣品。,,,,ConA對(duì)基于辣根過氧化酶的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)具有交叉反應(yīng),臨床檢測(cè),應(yīng)用本ELISA方法對(duì)四頭接種rPRV-HA豬連續(xù)四周的免疫血清進(jìn)行?-干擾素檢測(cè)。,,在接種重組病毒后一周，血清中?-干擾素水平迅速升高，隨后總體呈下降趨勢(shì),討 論,本實(shí)驗(yàn)以帶有融合

14、標(biāo)簽和信號(hào)肽的rpIFN-?為抗原，以rpIFN-?和不含任何庸余序列的豬IFN-?標(biāo)準(zhǔn)品交叉對(duì)單克隆抗體進(jìn)行篩選和鑒定，既節(jié)省了昂貴的標(biāo)準(zhǔn)抗原，又減少了單克隆抗體篩選過程中不必要的時(shí)間浪費(fèi)本實(shí)驗(yàn)采用免疫親和層析的方法從小鼠腹水中純化單克隆抗體，從而保證了所得抗體的特異性用雞作宿主,高滴度抗體出現(xiàn)時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，因而可實(shí)現(xiàn)抗體的大規(guī)模生產(chǎn) ConA能結(jié)合含α-D-呋喃甘露糖和α-D-呋喃葡萄糖糖基的糖蛋白或多糖，而抗體分子，辣

15、根過氧化酶（HRP）富含甘露糖殘基，這可能就是本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法對(duì)ConA產(chǎn)生交叉反應(yīng)的直接原因,結(jié) 論,成功制備了一株抗豬?-干擾素的單抗，該單抗能夠被商品化豬IFN-?和體外誘導(dǎo)的IFN-?所識(shí)別利用免疫親和層析純化得到豬?-干擾素特異性的卵黃抗體，平均每個(gè)抗體分子可標(biāo)記4.37個(gè)生物素分子以親和純化的抗豬?-干擾素單抗作為捕獲抗體，生物素標(biāo)記的卵黃抗體作為檢測(cè)抗體，初步建立了豬?-干擾素定量抗原捕獲ELISA檢測(cè)方

16、法，其最小檢出濃度可達(dá)7.8ng/mL ConA對(duì)基于辣根過氧化酶的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)具有交叉反應(yīng),致 謝,本實(shí)驗(yàn)是在哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物二室完成的。感謝導(dǎo)師童光志研究員和陳煥春教授三年來對(duì)我辛勤的培育和無私的幫助！,發(fā) 表 論 文,1. 余斌，張強(qiáng)，閆麗萍，陳煥春，童光志.抗豬γ-干擾素單克隆抗體的制備和鑒定.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào) （已接收）2. 豬γ-干擾素定量抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立（擬發(fā)