抗豬IFN-β和IFN-γ單克隆抗體的制備及豬IFN-β雙抗體夾心ELISA方法的初步建立.pdf

1、免疫功能可以分為天然免疫和獲得性免疫兩部分。機(jī)體的天然免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗病原微生物(病毒、細(xì)菌等)入侵的第一道防線，同時(shí)也是獲得性免疫的基礎(chǔ)。Ⅰ型干擾素的分泌和表達(dá)是天然免疫的一個(gè)重要方面，它包括IFN-α和IFN-β。和Ⅰ型干擾素相比Ⅲ型干擾素只能由NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞Th亞群產(chǎn)生，包括IFN-γ，它是重要的免疫調(diào)節(jié)因子又被稱為免疫干擾素。本研究制備了IFN-β和IFN-γ的單克隆抗體并利用制備的單克隆抗體初步建立

2、了豬IFN-β的雙抗體夾心ELISA方法，具體工作如下：
　　 1.豬IFN-β、IFN-γ基因的克隆和表達(dá)
　　 根據(jù)GenBank提交的豬IFN-β、IFN-γ的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以PK-15細(xì)胞RNA為模板通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得豬IFN-β基因和IFN-γ基因，大小分別為498bp和444bp。將PCR產(chǎn)物分別克隆到原核表達(dá)載體pET-28a和真核載體pCAGGS-HA中，獲得豬IFN-β和IFN-γ基因的原

3、核表達(dá)質(zhì)粒和真核表達(dá)質(zhì)粒。將豬IFN-β和IFN-γ基因的原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，兩種質(zhì)粒均能正確表達(dá)相應(yīng)的蛋白，并且表達(dá)的豬IFN-β主要以包涵體形式存在，而豬IFN-γ主要以可溶性形式存在。將豬IFN-β和IFN-γ基因的真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，經(jīng)Western blot證實(shí)兩種質(zhì)粒均能在體外培養(yǎng)細(xì)胞中正確表達(dá)相應(yīng)的蛋白。
　　 2.抗豬IFN-β、IFN-γ單克隆抗體的制備

4、　　 以原核表達(dá)蛋白免疫BALB/C小鼠，進(jìn)行二次免疫后斷尾采血檢測(cè)免疫效價(jià)并進(jìn)行細(xì)胞融合。當(dāng)血清效價(jià)達(dá)到1:6400后取脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，利用間接ELISA進(jìn)行篩選，共篩選到抗豬IFN-β的單克隆抗體4株，抗豬IFN-γ的單克隆抗體8株，并經(jīng)Western blot和間接免疫熒光證實(shí)所得單克隆抗體均能與真核表達(dá)的相應(yīng)蛋白發(fā)生特異性的反應(yīng)。
　　 3.抗豬IFN-β的單克隆抗體的純化和酶標(biāo)
　　 將

5、獲得的4株分泌抗豬IFN-β單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后接種BALB/C小鼠制備腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化后，用SDS-PAGE檢測(cè)證實(shí)獲得了純度高的單抗，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純化后4株單克隆抗體的濃度分別為2D126.9mg/ml、4A64.2 mg/ml、2H63.4 mg/ml、4G72.5 mg/ml。將純化后的單抗用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記，每株抗體標(biāo)記3mg，標(biāo)記完成后用間接ELISA檢測(cè)效價(jià)。檢測(cè)4株酶標(biāo)抗體的效價(jià)分

6、別為2D121:12800、4A61:12800、2H61:32004G71:1000。
　　 4.豬IFN-β雙抗體夾心ELISA方法的初步建立及應(yīng)用
　　 以CHO細(xì)胞表達(dá)的豬IFN-β為抗原，將4株純化抗體和酶標(biāo)抗體兩兩配對(duì)進(jìn)行雙抗體夾心實(shí)驗(yàn)，結(jié)果當(dāng)以2D12為包被抗體、以4A6為酶標(biāo)抗體時(shí)，建立的ELISA方法的特異性和敏感性最好。進(jìn)一步優(yōu)化條件最終確定包被抗體的最佳包被濃度為2μg/ml，酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度為