豬IFN-γ及其受體的生物學(xué)功能研究.pdf

1、IFN-γ是由機(jī)體內(nèi)活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，絲裂原以及抗原特異性刺激的T細(xì)胞克隆也可產(chǎn)生和分泌。IFN-γ除具有抗病毒、抗胞內(nèi)寄生菌、抗胞內(nèi)寄生原蟲、抗細(xì)胞增殖的作用外，還具有獨(dú)特而強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，可促進(jìn)MHCⅡ類抗原的表達(dá)，增強(qiáng)APC與T細(xì)胞的相互作用，增強(qiáng)Th細(xì)胞和CTL轉(zhuǎn)化的能力等。IFN-γ有較為嚴(yán)格的種屬特異性，不同物種之間通用使其活性降低或失去作用。 IFN-γ活性形式為兩條單體鏈結(jié)合形成的同

2、型二聚體形式，單體沒有生物學(xué)活性。IFN-γ作為機(jī)體免疫應(yīng)答的產(chǎn)物，一方面是機(jī)體發(fā)揮免疫功能，清除胞內(nèi)寄生病原體不可缺少的成分，與疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系；另一方面，機(jī)體內(nèi)IFN-γ分泌過量，可引起病理性反應(yīng)。由于IFN-γ具有上述諸多重要的生物學(xué)活性，故其在疾病的診斷、治療和預(yù)防等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，IFN-γ在臨床應(yīng)用時可引起發(fā)熱、寒戰(zhàn)、惡心等一系列的副作用，而且有些不良反應(yīng)是不可逆的損害，這限制了其在臨床中的應(yīng)用。

3、因此，開展新型、低毒副作用的pIFN-γ研究意義重大。 此外。IFN-γ必須與受體相結(jié)合，通過受體的介導(dǎo)才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，對其受體的研究將有利于明確IFN-γ的作用機(jī)制，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)疾病治療和預(yù)防的新途徑。 本論文在對克隆的pIFN-γ基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑?，去除其信號肽序列，將該基因與pGEX-4T-1載體上的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)拼接，然后在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，并對其誘導(dǎo)表達(dá)條件、蛋白純化方法進(jìn)行系統(tǒng)研究，最終

4、獲得了純度高達(dá)95％的GST-pIFN-γ融合蛋白，產(chǎn)量為0.4～0.5g/L培養(yǎng)液。體外試驗(yàn)證實(shí)該重組蛋白具有較高的生物活性，可有效抑制PRV(DNA病毒)和FMDV(RNA病毒)的復(fù)制，并且具有穩(wěn)定、不宜降解和低毒副作用的優(yōu)點(diǎn)。開展了重組pIFN-γ體外抗弓形蟲研究，結(jié)果表明pIFN-γ可誘導(dǎo)豬腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗蟲作用，且隨pIFN-γ量的增加抗弓形蟲作用越明顯，但任何濃度的重組pIFN-γ對弓形蟲入侵PK15細(xì)胞無明顯影響。

5、 對pIFN-γ誘導(dǎo)永生化細(xì)胞(PK15細(xì)胞)凋亡的作用及其對細(xì)胞端粒酶的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高濃度pIFN-γ的長時間誘導(dǎo)下，PK15細(xì)胞端粒酶顯著下降，因此PK15細(xì)胞(腫瘤樣細(xì)胞)發(fā)生凋亡，具體表現(xiàn)為細(xì)胞變圓脫落，DNA出現(xiàn)典型的“梯狀帶”，熒光染色可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核固縮，有凋亡小體出現(xiàn)； 但如果用低濃度pIFN-γ進(jìn)行誘導(dǎo)作用，PK15細(xì)胞端粒酶明顯升高；該研究結(jié)果為IFN-γ臨床治療腫瘤提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)。

6、 以表達(dá)純化的GST-pIFN-γ作為抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞融合，再經(jīng)純化的GST-pIFN-γ和的帶組氨酸標(biāo)簽pIFN-γ作為包被抗原進(jìn)行篩選，最終獲得2株分泌pIFN-γ單抗的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)鑒定這兩株單抗抗體亞類均屬于IgG2a，輕鏈為k型，對雜交瘤細(xì)胞株的染色體組型、單抗的穩(wěn)定性及其識別的抗原位點(diǎn)等進(jìn)行分析，結(jié)果證明所獲2株單抗均表現(xiàn)穩(wěn)定，可滿足常規(guī)實(shí)驗(yàn)的要求。在對不同動物IFNGR兩條鏈基因序列比

7、對基礎(chǔ)上，選擇保守區(qū)段作為引物； 然后分離豬外周血淋巴細(xì)胞，經(jīng)刺激后提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法克隆了豬IFNGR兩條鏈基因，序列測定表明豬IFNGR1基因ORF為1413bp，共編碼470個氨基酸；豬IFNGR2基因ORF為1110bp，共編碼369個氨基酸。對不同物種IFNGR序列比較發(fā)現(xiàn)，不同物種間的差異比較大，據(jù)此推測這可能是IFN-γ種屬特異性的重要原因之一。 然后利用分子生物學(xué)軟件對兩條鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)

8、測，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增豬IFNGR胞外區(qū)片段并對其進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)鑒定該基因在原核中得到正確表達(dá)；開展了兩條受體鏈胞外區(qū)對pIFN-γ抗病毒活性的影響研究，發(fā)現(xiàn)豬IFNGR1胞外區(qū)可降低pIFN-γ抗病毒活性，而IFNGR2胞外區(qū)可增強(qiáng)pIFN-γ抗病毒活性，由此可知豬IFNGR兩條鏈均可結(jié)合pIFN-γ； 此外，推測豬IFNGR1具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能且是IFN－γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要執(zhí)行者，而IFNGR2則在IFN－γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起次要作用或沒