小菜蛾中腸絲氨酸蛋白酶基因的克隆、轉(zhuǎn)錄及其酶活的研究.pdf

1、絲氨酸蛋白酶家族是一個(gè)超基因家族，主要包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶兩大類，在昆蟲的免疫反應(yīng)、食物消化及蛻皮變態(tài)的過程中起著重要的作用。昆蟲從外界攝取的大分子營養(yǎng)物質(zhì)需經(jīng)腸道內(nèi)一系列的消化酶分解成小分子物質(zhì)后才能被蟲體吸收利用，因此，昆蟲對(duì)食物的消化和吸收對(duì)昆蟲的生長發(fā)育起著重要的作用。
　　 本文克隆了四個(gè)小菜蛾絲氨酸蛋白酶基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究。現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　 1)采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RA

2、CE)獲得了4條cDNA的全長序列，所克隆的4條全長cDNA序列命名為Pxsp-A、Pxsp-B、Pxsp-C和Pxsp-D，長度分別為914、924、933及1038bp，開放閱讀框長度分別為795、768、816及879bp，分別編碼264、255、271、292個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量分別為28.8kDa、27.6kDa、29.7kDa、30.9kDa。序列分析結(jié)果表明，Pxsp-A、Pxsp-B、Pxsp-C及Pxsp-D均含有信號(hào)

3、肽序列。多序列比對(duì)結(jié)果表明，對(duì)絲氨酸蛋白酶基因做進(jìn)化樹分析，4個(gè)基因形成了3大組，第一組為Pxsp-A，第二組由Pxsp-B和Pxsp-C組成，第三組為Pxsp-D。
　　 2)明確了絲氨酸蛋白酶基因在小菜蛾不同齡期中的轉(zhuǎn)錄規(guī)律。分別于小菜蛾2齡中、3齡初、3齡末、4齡初、4齡中、4齡末6個(gè)不同發(fā)育期取樣，提取中腸RNA，進(jìn)行rt-qPCR檢測。結(jié)果顯示，在小菜蛾2齡中期至4齡中期，Pxsp-A、Pxsp-B、Pxsp-C及Px

4、sp-D四個(gè)基因的表達(dá)量逐漸升高，并且在4齡中達(dá)到峰值，而后基因的表達(dá)量逐漸回落，且Pxsp-B和Pxsp-C的表達(dá)量顯著高于Pxsp-A及Pxsp-D。
　　 3)明確了菜蛾盤絨繭蜂寄生對(duì)絲氨酸蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。分別于寄生后0h、24h、48h、72h、96h取寄主小菜蛾幼蟲各30頭，進(jìn)行取樣，提取中腸RNA。同時(shí)，以未寄生小菜蛾為對(duì)照，提取小菜蛾中腸RNA，進(jìn)行rt-qPCR檢測。結(jié)果顯示，寄生后Pxsp-A、Px

5、sp-B、Pxsp-C及Pxsp-D的表達(dá)量均有所下降，而且寄生對(duì)Pxsp-C的影響最大，其次是Pxsp-B和Pxsp-D，寄生對(duì)Pxsp-A的影響最小。
　　 4)探究了菜蛾盤絨繭蜂寄生對(duì)寄主小菜蛾中腸絲氨酸蛋白酶酶活的影響。結(jié)果顯示，從2齡至4齡末期，未寄生小菜蛾中腸內(nèi)總絲氨酸蛋白酶的活性略高于寄生后小菜蛾;其次，寄生后中腸內(nèi)各類消化酶成分發(fā)生顯著變化，中腸中酶平衡被打破;最后，小菜蛾被寄生后其中腸內(nèi)的總絲氨酸蛋白酶、胰蛋白

6、酶、胰凝乳蛋白酶活性均產(chǎn)生了明顯變化。我們還檢測了蛋白酶抑制劑對(duì)小菜蛾中腸酶活性的影響。當(dāng)分別加入抑制劑4-amidinophenylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride(APMSF)和(S)-1-chloro-4-phenyl-3-tosylamido-2-butanone(TPCK)時(shí)總蛋白酶的活性受到抑制;當(dāng)以胰蛋白酶作為底物時(shí)，APMSF對(duì)胰蛋白酶有顯著抑制作用，而TPCK抑制作用有限;當(dāng)