Wnt信號誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和增殖的研究.pdf

1、目的：
　　后囊下混濁(posterior capsular opacification，PCO)是白內(nèi)障摘除術(shù)后最常見的并發(fā)癥，常常導(dǎo)致術(shù)后視力下降。晶狀體上皮細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition EMT)和增殖在PCO的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。Wnt配體蛋白參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及分化等眾多生理過程，對人晶狀體上皮細(xì)胞中Wnt3a介導(dǎo)的經(jīng)典wnt信號通路目前研究甚少。本研究將w

2、nt3a與經(jīng)典wnt信號通路相關(guān)聯(lián)，通過構(gòu)建wnt3a過表達(dá)載體應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)使人晶狀體上皮細(xì)胞中過表達(dá)wnt3a配體蛋白，激活經(jīng)典wnt信號通路，探討其對晶狀體上皮細(xì)胞EMT和增殖能力的影響，初步明確wnt在晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生PCO的作用機(jī)制。同時(shí)，力求從中找到新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.構(gòu)建Wnt3a過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，酶切、測序進(jìn)行鑒定。
　　2.應(yīng)用Lipo2000轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a過表達(dá)載體，人晶

3、狀體上皮細(xì)胞HLE B-3細(xì)胞和SRA01/04細(xì)胞過表達(dá)Wnt3a蛋白，用Western Blotting技術(shù)驗(yàn)證其表達(dá)。
　　3.用趨化運(yùn)動實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測Wnt3a過表達(dá)對晶狀體上皮細(xì)胞的遷移運(yùn)動能力影響。
　　4.采用MTT和流式細(xì)胞儀檢測Wnt3a過表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響。
　　5.用Western Blotting檢測Wnt3a過表達(dá)后其下游信號分子β-catenin的活化程度。用免疫熒光的方法檢測β-

4、catenin在細(xì)胞中的定位情況，觀察在Wnt3a刺激后，它們的分布變化，進(jìn)一步明確Wnt/β-catenin信號通路的激活狀態(tài)。
　　6.應(yīng)用Western Blotting方法檢測Wnt3a過表達(dá)對晶狀體上皮細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白和相關(guān)核內(nèi)靶基因表達(dá)的影響，用免疫熒光的方法檢測上皮和間充質(zhì)標(biāo)記蛋白在細(xì)胞中的定位情況，進(jìn)一步明確Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞形成PCO中的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　

5、　1.成功構(gòu)建Wnt3a-pcDNA3真核表達(dá)載體，基因測序與Genebank一致。
　　2.正常人晶狀體上皮細(xì)胞系僅有少量Wnt3a表達(dá)。Wnt3a-pcDNA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后獲得Wnt3a過表達(dá)晶狀體上皮細(xì)胞系。
　　3.wnt3a過表達(dá)上調(diào)HLE B-3細(xì)胞內(nèi)β-catenin的蛋白表達(dá)，并促使HLE B-3細(xì)胞和SRA01/04細(xì)胞內(nèi)的β-catenin細(xì)胞定位由胞漿轉(zhuǎn)入胞核。
　　4.與對照組相比，Wnt3a過表

6、達(dá)的HLE B-3細(xì)胞和SRA01/04細(xì)胞的遷移運(yùn)動能力比對照組細(xì)胞明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
　　5.Wnt3a過表達(dá)促進(jìn)HLE B-3細(xì)胞和SRA01/04細(xì)胞的增殖(P<0.01)，細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)在S期細(xì)胞的比例升高。
　　6.與對照組相比，Wnt3a過表達(dá)的HLE B-3細(xì)胞和SRA01/04細(xì)胞的上皮表型E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)表型fibronectin表達(dá)升高；并且經(jīng)免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Wnt3a過表

7、達(dá)的HLE B-3細(xì)胞和SRA01/04細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　7.Wnt3a過表達(dá)使HLE-B3細(xì)胞和SRA01/04細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.Wnt3a-pcDNA3真核表達(dá)載體能有效上調(diào)人晶狀體上皮細(xì)胞Wnt3a蛋白的表達(dá)，使Wnt/β-catenin信號通路活化。
　　2.Wnt3a過表達(dá)能夠增強(qiáng)晶狀體上皮細(xì)胞的運(yùn)動遷移能力。