Eaf2通過Wnt信號通路抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、1前言:
　　目前白內(nèi)障患者導(dǎo)致的眼盲占全世界眼盲患者的50％，現(xiàn)在公認(rèn)眼內(nèi)晶狀體受到氧化應(yīng)激的損傷是白內(nèi)障的主要原因。上皮細(xì)胞是氧化應(yīng)激的主要目標(biāo)。研究表明，過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激能夠刺激人晶狀體上皮(HLE)細(xì)胞凋亡，還有研究顯示除了先天性白內(nèi)障以外，其他各種類型的白內(nèi)障發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)都被認(rèn)為是和細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此通過研究人HLE細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能會為白內(nèi)障防治提供更多理論依據(jù)。
　　2目的:
　　研究在氧化應(yīng)激

2、誘導(dǎo)的HLE細(xì)胞的凋亡中Eaf2基因所起的作用和相關(guān)分子機(jī)制，并進(jìn)一步探討Eaf2基因如何通過抑制caspase-3活性、激活Wnt信號通路保護(hù)HLE細(xì)胞抑制過氧化氫導(dǎo)致的凋亡。
　　3方法:
　　3.1細(xì)胞培養(yǎng):在含20％ FBS的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)HLE-B3細(xì)胞。培養(yǎng)條件:5％CO2、飽和濕度、37℃。
　　3.2過氧化氫誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞凋亡:將HLE-B3細(xì)胞用50μM過氧化氫別處理4h、8h和12h。

3、r>　　3.3載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染:構(gòu)建Eaf2的過表達(dá)，Eaf2基因的CDS全長被克隆并連接到pcDNA3.0載體;用Wnt3a干擾載體(Wnt3ashRNA)敲低Wnt3a，Wnt3ashRNA購自SantaCruz生物，同時匹配其NC，shCon（干擾載體空載）。確認(rèn)Eaf2過表達(dá)的細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染shWnt3a/shCon。
　　3.4檢測分析細(xì)胞凋亡:將過氧化氫處理HLEC-B3細(xì)胞后，用流式儀檢測細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。

4、　　3.5 RNA提取和RT-PCR分析:采用TRIZOL法從細(xì)胞中提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，用2-(ΔΔ)Ct計(jì)算方法來比較各組間β-catenin，caspase3，Eaf2，andWnt3a mRNA的表達(dá)水平。
　　3.6免疫印跡分析:采用western blot檢測β-catenin，caspase3，Eaf2，and Wnt3a的蛋白水平。
　　3.7免疫細(xì)胞化學(xué):免疫熒光檢測Eaf2和Wnt3a在細(xì)

5、胞中的定位情況。
　　4結(jié)果:
　　4.1.構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)的HLE細(xì)胞凋亡的模型。
　　分別用50μM H2O2處理HLE細(xì)胞4、8、12小時后，凋亡細(xì)胞的比率均顯著高于對照組（無H2O2處理組），并且凋亡率增加具有時間依賴性。RT-PCR和westernBlot結(jié)果均顯示當(dāng)細(xì)胞暴露于H2O2后，HLE-B3細(xì)胞中caspase3mRNA和蛋白水平均明顯上調(diào)，并且具有時間依賴性;Eaf2mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)，并

6、且具有時間依賴性。
　　4.2 Eaf2過表達(dá)抑制H2O2誘導(dǎo)的HLE細(xì)胞凋亡。
　　Eaf2高水平過表達(dá)下，凋亡細(xì)胞的比例顯著降低(p＜0.001)，同時LDH釋放量顯著降低(p＜0.05)。RT-PCR和western blot分析顯示Eaf2過表達(dá)的細(xì)胞中，凋亡相關(guān)蛋白caspase3、Bax的mRNA和蛋白水平顯著下調(diào);Bcl-2的mRNA和蛋白達(dá)水平顯著上調(diào)，說明Eaf2基因通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而抑制過氧化氫

7、誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡。Eaf2過表達(dá)的細(xì)胞中Wnt3a和Wnt通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin的mRNA和蛋白達(dá)水平均顯著上調(diào);Wnt通路中的抑制劑GSK3β蛋白水平明顯下調(diào)，其磷酸化物p-GSK3β蛋白水平明顯上調(diào)，提示Eaf2and Wnt3a信號通路有密切的關(guān)系。免疫熒光也顯示Eaf2過表達(dá)細(xì)胞中Eaf2和Wnt3a明顯上調(diào)。
　　4.3 Eaf2通過調(diào)控Wnt3a抑制HLE細(xì)胞中H2O2誘導(dǎo)的凋亡
　　轉(zhuǎn)染shW

8、nt3a質(zhì)粒干擾Wnt3a表達(dá)后，即使在Eaf2過表達(dá)情況下，HLE-B3細(xì)胞凋亡總比率仍顯著增加，同時使已經(jīng)被壓抑的LDH釋放量增加。RT-PCR和westem blot顯示W(wǎng)nt3a敲低后caspase3、Bax的mRNA和蛋白水平明顯上調(diào);Bcl-2的mRNA和蛋白水平明顯下調(diào)，β-catenin、p-GSK3β的蛋白水平明顯下調(diào);GSK3β蛋白水平明顯上調(diào)。說明Wnt3a被敲低后會影響到Eaf2對于HLE細(xì)胞的保護(hù)作用，Eaf2

9、是通過調(diào)控Wnt3a抑制HLE細(xì)胞中H2O2誘導(dǎo)的凋亡。
　　5.結(jié)論:
　　5.1 H2O2可以誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　5.2在晶狀體上皮細(xì)胞中可有效地轉(zhuǎn)染Eaf2OE質(zhì)粒及shWnt3a質(zhì)粒。
　　5.3 Eaf2蛋白對過氧化氫誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡具有抑制作用。
　　5.4第一次證明Eaf2基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以保護(hù)HLE細(xì)胞免受暴露于過氧化氫導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損害。
　　5.5 Eaf2通