氯通道參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞容積變化的相關(guān)機制研究.pdf

1、目的：以過氧化氫損傷HLEB-3細胞為氧化應(yīng)激損傷的模型，觀察氯通道阻斷劑DIDS和NPPB對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞HLE-B3損傷的影響,并通過細胞容積調(diào)節(jié)的角度初步探討氯通道阻斷劑對氧化應(yīng)激下HLEB-3保護的作用途徑及其相關(guān)的分子機制。
　　材料和方法：1.Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件控制下實現(xiàn)時滯拍攝固定視野內(nèi)活細胞圖像分析HLEB-3在低滲刺激下細胞容積的改變，并通過細胞外溶液氯離子置換和氯通道阻

2、斷劑干預(yù)的方式闡明氯通道在RVD中所起到的作用。
　　2. HLE-B3氧化應(yīng)激損傷模型的建立及氯通道阻斷劑保護作用的觀察，外源性500μmol/L過氧化氫（H2O2）作用于HLEB-3細胞，細胞外溶液氯離子置換及氯通道阻斷劑（NPPB、DIDS）梯度濃度作用于氧化應(yīng)激下HLE B-3細胞，通過光鏡和吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）熒光染色觀察細胞形態(tài)學(xué)及和核形態(tài)改變、MTT法檢測細胞生存力、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。
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3、.觀察氧化應(yīng)激下HLEB-3細胞凋亡及凋亡性細胞回縮的變化和氯通道阻斷劑（NPPB、DIDS）干預(yù)的影響。在500μmol/LH2O2作用于HLEB-3細胞的6h內(nèi)，通過MTT法檢測細胞生存力，Caspase-3活性檢測及Western Blot法檢測Caspase-3表達水平、DNA瓊脂糖電泳分析、和Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件控制下實現(xiàn)時滯拍攝固定視野內(nèi)活細胞圖像，分析細胞凋亡、Caspase-3表達變化及細胞容積

4、的動態(tài)變化。
　　結(jié)果：1.在低滲細胞外灌流液作用下，HLEB-3細胞的容積脹大且呈滲透壓相關(guān)性，同時調(diào)節(jié)性容積回縮（RVD）能力增強。通過硝酸根離子取代灌流液中的氯離子方式耗竭細胞內(nèi)氯離子，這時觀察到RVD消失，而用氯通道阻斷劑也可以得到相似結(jié)果。
　　2.采用不同濃度的氯通道阻斷劑NPPB或DIDS干預(yù)下，細胞存活率呈藥物劑量依賴性升高，其中100μmol/L，200μmol/L這兩個濃度NPPB和DIDS干預(yù)組細胞存活

5、率與H2O2處理組相比較，差異存在顯著性（n＝5，P<0.01）。氯通道阻斷劑NPPB(100mol/L)及DIDS(100mol/L)皆可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細胞凋亡及細胞容積減少，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞6h后，測得細胞凋亡率為（72.06±2.73）％，加用NPPB及DIDS后，凋亡率則將為（20.78±2.62）%和（15.83±2.57）%。
　　3.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡早期即可觀察到細胞容積減小。在連續(xù)觀察的6

6、h中，細胞容積逐漸減小，6h末細胞容積減少(26.98±2.35)%。氯通道阻斷劑NPPB(100 moL/L)及DIDS(100moL/L)顯著抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)性容積減小，分別為(6.81±0.57)%和(7.03±0.67)％。
　　結(jié)論：1.Cl-是HLEB-3細胞調(diào)節(jié)性容積回縮（RVD）的關(guān)鍵性離子，Cl-分泌是實現(xiàn)RVD的關(guān)鍵因素，氯通道阻斷劑阻斷氯通道，幾乎完全或大部分阻斷RVD，表明氯通道開放是HLEB-3