血紅素加氧酶-1在過(guò)氧化氫介導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)旨在研究血紅素加氧酶-1(HO-1)在過(guò)氧化氫(H2O2)介導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞（hLEC;SRA01/04細(xì)胞系）氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡中的保護(hù)性作用。
　　方法:hLEC分別在H2O2濃度梯度、HO-1誘導(dǎo)劑:鈷原卟啉(CoPP)、鋅原卟啉(ZnPP)濃度梯度的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)，基因沉默技術(shù)成功降低HO-1在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并用于本實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞存活率使用CCK-8法進(jìn)行觀察。細(xì)胞內(nèi)HO-1的表達(dá)水平利用蛋白質(zhì)印跡(W

2、estern blot)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中，人晶狀體上皮細(xì)胞在400μM H2O2中預(yù)培養(yǎng)24h建立了氧化應(yīng)激損傷模型，10μM CoPP和10μM ZnPP良好地誘導(dǎo)了HO-1并避免了嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。免疫熒光雙標(biāo)法用于細(xì)胞鑒定及HO-1胞內(nèi)表達(dá)的測(cè)定。DCFH-DA熒光探針用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平。谷胱甘肽(GSH)和超氧化物岐化酶(SOD)水平檢測(cè)使用微孔法商業(yè)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。Annexi

3、n V-FITC/PI染色用于量化不同處理組人晶狀體上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡率，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族-3、-8(Caspase-3、-8)使用蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:1、HO-1顯著地降低ROS水平和增加GSH及SOD活性，從而明顯地減輕了H2O2介導(dǎo)的hLEC氧化應(yīng)激損傷。2、HO-1抑制H2O2介導(dǎo)的促進(jìn)凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8，因此顯著地降低了hLEC的凋亡率。3、RNA干擾驗(yàn)證了HO-1