硫醇轉(zhuǎn)移酶在高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的表達(dá)和作用研究.pdf

1、目的:
　　硫醇轉(zhuǎn)移酶(Thioltransferase,TTase),是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種小分子蛋白,它能夠特異性地催化還原硫醇化的蛋白質(zhì),使其二硫鍵斷裂,對于晶狀體內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)的維持具有重要的作用。高濃度葡萄糖可通過多種途徑誘發(fā)氧化應(yīng)激,最終導(dǎo)致糖尿病性白內(nèi)障的形成。本研究旨在觀察TTase在高糖培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞(HLE B3)中的表達(dá)和活性,初步探討TTase在對抗高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中可能的作用及機制,為闡明糖基化和

2、氧化損傷修復(fù)的相互作用奠定基礎(chǔ)。本實驗第一部分觀察了不同濃度葡萄糖作用不同時間對體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞TTase表達(dá)和活性的影響,第二部分利用RNA干擾技術(shù)手段使人晶狀體上皮細(xì)胞TTase表達(dá)下調(diào),在此基礎(chǔ)上給予高糖孵育,測定并比較人晶狀體細(xì)胞內(nèi)ROS、GSSG含量、SOD和CAT活性變化和細(xì)胞凋亡情況,探討TTase可能的作用機制。
　　方法:
　　1.將人晶狀體上皮細(xì)胞用含不同濃度的葡萄糖(5.5mmol/L,25.

3、5mmol/L,35.5mmol/L和45.5mmol/L,其中5.5mmol/L設(shè)為正常對照組,其余三個濃度設(shè)為高糖組),胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為10％的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),并設(shè)立各濃度高糖相應(yīng)滲透壓的甘露醇高滲對照組,分別于1d,2d,3d,4d收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,用qRT-RCR技術(shù)檢測TTase mRNA含量。根據(jù)不同濃度高糖實驗結(jié)果,選擇35.5mmol/L高糖為實驗高糖濃度,Western blot檢測細(xì)胞在該高糖濃度培養(yǎng)

4、下1～4d TTase的表達(dá),并測定TTase活性。
　　2.利用脂質(zhì)體法將TTase siRNA轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞,測定轉(zhuǎn)染及干擾效率,篩選最佳siRNA作為后續(xù)實驗用。設(shè)立正常對照組,高糖組,TTase RNA干擾組和TTase RNA干擾+高糖組,3d后測定細(xì)胞內(nèi)TTase活性,ROS含量,GSSG/T-GSH,SOD和CAT活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.在同一濃度的高糖培養(yǎng)液中,TT

5、ase mRNA含量在2d內(nèi)逐漸增高,2d后開始下降。在25.5mmol/L高糖培養(yǎng)中,TTase在1～3d的mRNA含量分別為正常對照的2.53,6.06,3.33倍,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),4d時降至正常水平(P>0.05);在35.5mmol/L高糖培養(yǎng)中,TTase在1～3d的mRNA含量分別為正常對照的6.24,9.28,3.12倍,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),4d時降至正常水平(P>0.05);在45.5

6、mmol/L高糖培養(yǎng)中,TTase mRNA含量雖然在1d和3d較正常對照增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),在2d時為正常對照的6.01倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),4d時降至正常水平(P>0.05)。各高糖濃度對應(yīng)的甘露醇高滲對照組TTase mRNA含量與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。Western blot結(jié)果顯示TTase表達(dá)在1～4d逐漸增強,從2d開始與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0

7、5)。正常對照組TTase活性為6.69±0.47mU/mg protein,在35.5mmol/L高糖培養(yǎng)中,1～4d TTase活性先逐漸增強,隨后又降低,分別為8.37±1.24,10.19±0.66,11.23±1.75,10.50±0.70mU/mg protein,2～4d時TTase活性與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記的siRNA平均轉(zhuǎn)染效率為81%,篩選出的最佳TT

8、ase siRNA可使晶狀體上皮細(xì)胞TTase表達(dá)降至正常對照的39.5%(P<0.05)。在正常對照組、高糖組、TTase RNA干擾組和TTase RNA干擾+高糖組中,細(xì)胞TTase活性分別為6.68±0.47,11.23±1.75,3.58±0.70,5.49±1.15mU/mg protein,與正常對照組相比,高糖組細(xì)胞內(nèi)TTase活性升高(P<0.01),TTase RNA干擾組TTase活性降低(P<0.05),TTas

9、e RNA干擾+高糖組與正常對照組比較無顯著性差異(P>0.05);正常對照組、高糖組、TTase RNA干擾組和TTase RNA干擾+高糖組的細(xì)胞ROS含量測定結(jié)果分別為155.70±11.50,186.33±11.59,219.00±11.00,265.33±16.50相對熒光單位,RNA干擾+高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS含量最高,與其他各組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);正常對照組、高糖組、TTase RNA干擾組和TTase RN

10、A干擾+高糖組的GSSG/T-GSH結(jié)果分別為:(3.81±1.08)%,(8.97±0.95)%,(10.96±1.28)%,(14.15±1.48)%,RNA干擾+高糖組細(xì)胞內(nèi)GSSG/T-GSH最高,與其他各組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);正常對照組、高糖組、TTase RNA干擾組和TTase RNA干擾+高糖組細(xì)胞的SOD活性測定結(jié)果分別為114.80±9.49,88.17±7.92,69.65±7.23,47.15±

11、5.41U/mg protein,CAT活性測定結(jié)果分別為12.13±1.39,8.33±1.14,6.04±0.64,4.46±0.74 U/mg protein,TTase RNA干擾+高糖組細(xì)胞SOD和CAT活性與其他組比較均有顯著性降低(P<0.05),但各實驗組細(xì)胞凋亡均不明顯,凋亡率差異無顯著性(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　高濃度葡萄糖可使體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞ROS含量增加,誘發(fā)氧化應(yīng)激,細(xì)胞內(nèi)GSH