硫醇轉(zhuǎn)上移酶在皮細(xì)胞晚期糖氧化應(yīng)基化終激中的產(chǎn)物誘表達(dá)和導(dǎo)的人作用研晶狀體究.pdf

1、目的：
　　糖尿病持續(xù)高血糖狀態(tài)下，晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）含量相對(duì)上升，會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能參與糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。硫醇轉(zhuǎn)移酶（Thioltransferase，TTase）作為巰基-二硫化物氧化還原酶家族中的成員，對(duì)晶狀體氧化還原平衡狀態(tài)的維持具有非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察AGEs對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化還原狀態(tài)和TTase表達(dá)的影響，初步研究在AGE

2、s誘導(dǎo)引發(fā)的氧化損傷中，TTase可能參與的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探究糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制提供新思路。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組采用AGEs-BSA濃度為1.5 mg/ml，10％（v/v）胎牛血清的低糖 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；陰性對(duì)照組加入相同濃度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），分別于1 d，2 d，3 d，4 d收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量，SOD，CAT活

3、性，并且測(cè)定TTase活性，qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)TTase mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)TTase蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。
　　2.將前期篩選出來(lái)的轉(zhuǎn)染效率較為理想的TTase siRNA轉(zhuǎn)染至人晶狀體上皮細(xì)胞，測(cè)定干擾效率。設(shè)立正常對(duì)照組，AGEs-BSA組，AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對(duì)照組和AGEs-BSA+TTase siRNA干擾組，培養(yǎng)2d后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量，SOD活性、CAT活性和GSS

4、G/T-GSH。
　　結(jié)果：
　　1. AGEs-BSA處理后細(xì)胞內(nèi)ROS含量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，測(cè)得1 d，2 d，3 d，4 d ROS含量分別為：153.67±24.57，180±11.55，268.01±20.50和313.33±35.46相對(duì)熒光單位，較正常對(duì)照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。測(cè)得細(xì)胞內(nèi)CAT活性于1 d，2 d，3 d，4 d時(shí)分別為10.07±0.84，9.27±0.72，

5、7.05±0.88和5.30±1.67 U/mg protein，其中2 d，3 d，4 d較正常對(duì)照組有明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），SOD活性于1 d，2 d，3 d，4 d分別為104.21±3.95，92.98±8.98，86.54±3.57和81.56±5.06 U/mg protein，較正常對(duì)照組有顯著性下降（P<0.05），CAT與SOD的活性均隨著時(shí)間作用延長(zhǎng)逐漸下降，BSA對(duì)照組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異

6、。
　　2. AGEs-BSA處理后晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)TTase mRNA表達(dá)水平增高，于2 d時(shí)達(dá)到峰值，約為正常對(duì)照組的5.06倍（P<0.01）。隨后表達(dá)開始下降，3d時(shí)為正常對(duì)照組的3.53倍（P<0.01）。4 d時(shí)繼續(xù)下降，為正常對(duì)照組的3.10倍。TTase活性1 d，2 d，3 d，4 d分別為8.03±0.86，10.82±0.51，11.05±0.83，8.63±0.77 mU/mg protein，呈先上升后下

7、降的趨勢(shì)。培養(yǎng)至2 d時(shí)，為正常對(duì)照組的1.53倍，于3 d時(shí)，為正常對(duì)照組的1.69倍，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。BSA處理組TTase活性于1~4 d未見明顯變化趨勢(shì)。AGEs-BSA處理組3 d時(shí)TTase蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3. ROS含量測(cè)定結(jié)果在正常對(duì)照組、AGEs-BSA組、AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對(duì)照組以及 AGEs-BSA+ TTase s

8、iRNA干擾組中，分別為93.33±21.85，190.30±9.84，188.02±19.31和280.32±18.35相對(duì)熒光單位，AGEs-BSA+TTase siRNA干擾組細(xì)胞內(nèi)ROS含量與AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。GSSG/T-GSH結(jié)果在正常對(duì)照組、AGEs-BSA組、AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對(duì)照組以及 AGEs-BSA+ TTase siR

9、NA干擾組分別為：(3.20±0.47)%，(11.35±0.62)%，(10.86±1.50)%和(16.45±0.64)%，AGEs-BSA+TTase siRNA干擾組細(xì)胞內(nèi)GSSG/T-GSH最高，與AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。正常對(duì)照組、AGEs-BSA組、AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對(duì)照組以及 AGEs-BSA+TTase siRNA干擾組的 SOD活性

10、測(cè)定結(jié)果分別為119.77±8.42，92.98±8.98，79.78±6.05和54.15±9.06 U/mg protein。CAT活性測(cè)定結(jié)果分別為15.07±0.78，9.27±0.73，9.01±1.52和4.01±0.94 U/mg protein，AGEs-BSA+TTase siRNA干擾組細(xì)胞SOD和CAT活性與AGEs-BSA+TTase siRNA陰性對(duì)照組比較顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：