高糖對人晶狀體上皮細(xì)胞iNOS表達(dá)機(jī)制及丹酚酸B作用的研究.pdf

1、目的：在全球致盲疾病中，白內(nèi)障位居第一。近年來，隨著糖尿病發(fā)病率的迅猛增長，糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract，DC)已成為糖尿病患者失明的主要原因。在我國，年齡標(biāo)準(zhǔn)化后的總糖尿病患病率和前驅(qū)糖尿病患病率分別達(dá)9.7％和15.5％，其中有9240萬成年糖尿病患者和1.5億成年前驅(qū)糖尿病患者。2型糖尿病患者的白內(nèi)障發(fā)病率竟達(dá)60％以上。因此，DC的發(fā)病機(jī)制及防治已成為當(dāng)前研究的焦點(diǎn)。
　　 研究證實，氧化應(yīng)激是糖尿

2、病慢性并發(fā)癥發(fā)生的主要機(jī)制，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，iNOS一旦被誘導(dǎo)，即可合成大量NO，活性持續(xù)可達(dá)20h。NO極易與超氧陰離子反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite，ONOO-)，而ONOO-及其衍生物是目前已知氧化能力最強(qiáng)的一類物質(zhì)，其氧化能力是H2O2的2000多倍，可引起劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)或加速DC的發(fā)生。

3、　　 已知氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶iNOS的主要調(diào)控因子是核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactor-kappa B，NF-κB)，而且其基因啟動子中含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)。常態(tài)下，NF-κB滯留于細(xì)胞質(zhì)中，以最常見的P65/P50二聚體形式存在，處于失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到高糖等因素刺激時，NF-κB被激活，移位至細(xì)胞核內(nèi)，與NF-κB調(diào)控位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能。
　　 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞株SR

4、A01/04受高糖刺激后，NF-κB P65的表達(dá)量明顯增加，并迅速移位至細(xì)胞核內(nèi)。那么，進(jìn)入細(xì)胞核后的NF-κB P65是否會與iNOS基因啟動子結(jié)合，高糖能否增強(qiáng)它們的結(jié)合能力，又能否激活iNOS基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，有待研究證實。
　　 丹酚酸B(Salvianolic acid B，SalB)為中藥丹參中重要的水溶性藥效成分，在結(jié)構(gòu)上含有多個游離酚羥基，具有極強(qiáng)的抗氧化和清除自由基能力，其抗氧化能力約為維生素E的1000倍，

5、是目前已知的抗氧化作用最強(qiáng)的天然產(chǎn)物之一，能夠抑制晶狀體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。那么，丹酚酸B對于DC的防治作用是什么，機(jī)制如何，是否與iNOS基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)?
　　 本實驗采用含高糖的DMEM培養(yǎng)基，孵育正常培養(yǎng)的SRA01/04細(xì)胞，觀察iNOS的表達(dá)變化，利用染色體免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)技術(shù)研究NF-κB P65與iNOS啟動子的結(jié)合能力。同時，本實驗還觀察了SalB對iN

6、OS表達(dá)的影響，為臨床防治DC提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)與分組
　　 選用人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04作為試驗用細(xì)胞，采用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長滿度達(dá)培養(yǎng)瓶底面積的80％時，進(jìn)行傳代。
　　 為研究葡萄糖對iNOS表達(dá)的影響，對細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組，按葡萄糖濃度的不同，分為4組：5.5mmol/L葡萄糖組(正常對照組)、15mmol/L葡萄糖組、25mmol/L葡萄

7、糖組、30mmol/L葡萄糖組，分別孵育細(xì)胞8h；按葡萄糖刺激細(xì)胞時間的不同，分為5組：0h組、1h組、2h組、4h組、8h組。
　　 為觀察SalB對iNOS表達(dá)的作用，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：5.5mmol/L葡萄糖組(正常對照組)、25mmol/L葡萄糖組、25mmol/L葡萄糖+30mmol/LSalB組、25mmol/L甘露醇組，分別孵育細(xì)胞8h。
　　 為探討高糖對iNOS表達(dá)影響的機(jī)制，用5.5mmol/L葡萄

8、糖組和25mmol/L葡萄糖組細(xì)胞進(jìn)行試驗。
　　 2.晶狀體上皮細(xì)胞iNOS轉(zhuǎn)錄水平的變化
　　 2.1總RNA的提?。篢rizol試劑盒法。
　　 2.2 mRNA的測定：用β-actin做內(nèi)參，利用RT-PCR法測定iNOS mRNA。
　　 3.晶狀體上皮細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的變化
　　 3.1細(xì)胞總蛋白的提取：細(xì)胞裂解液法。
　　 3.2蛋白定量：Lowry法。
　　 3

9、.3晶狀體上皮細(xì)胞iNOS蛋白的檢測：Western-blotting法。
　　 4.高糖對SRA01/04細(xì)胞iNOS表達(dá)影響的機(jī)制：ChIP技術(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同濃度葡萄糖對iNOS表達(dá)的影響
　　 高糖組iNOS mRNA的表達(dá)均升高，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；25mmol/L葡萄糖組和30mmol/L葡萄糖組iNOS mRNA的表達(dá)高于15mmol/L葡萄糖

10、組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；30mmol/L葡萄糖組高于25mmol/L葡萄糖組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(見附圖2-1、附圖2-2和附表1)
　　 Western-blotting檢測結(jié)果顯示，正常對照組iNOS含量最少，各高糖組iNOS含量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；30mmol/L葡萄糖組iNOS含量最高，與15mmol/L葡萄糖組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與25mm

11、ol/L葡萄糖組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(見附圖2-3、附圖2-4和附表1)
　　 2.高糖(25mmol/L)作用不同時間對iNOS表達(dá)的影響
　　 iNOS mRNA的表達(dá)量呈時間依賴性，4h組明顯增加，顯著高于0h組、1h組和2h組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；8h組最高，與其它各組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western-blotting結(jié)果同RT-PCR結(jié)果。(見附圖3-1、附

12、圖3-2、附圖3-3、附圖3-4和附表2)
　　 3.SalB對iNOS表達(dá)的影響
　　 與正常對照組相比，甘露醇組iNOS mRNA有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。25mmol/L葡萄糖組iNOS mRNA明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SalB組iNOS mRNA的表達(dá)高于正常對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與25mmol/L葡萄糖組相比，SalB組iNOSmRNA的表

13、達(dá)偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western-blotting檢測結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致。(見附圖4-1、附圖4-2、附圖4-3、附圖4-4和附表3)
　　 4.高糖對SRA01/04細(xì)胞iNOS表達(dá)影響的機(jī)制
　　 用含5.5mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基孵育的細(xì)胞，ChIP結(jié)果顯示：Input組和陽性抗體對照組有擴(kuò)增產(chǎn)物條帶出現(xiàn)，其余各組無條帶出現(xiàn)。用含25mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基孵育的細(xì)胞，ChIP結(jié)果

14、顯示：Input組、實驗組和陽性抗體對照組都有擴(kuò)增產(chǎn)物條帶出現(xiàn)，而陰性對照組和陰性抗體對照組無條帶出現(xiàn)。Input組條帶的光密度值明顯大于實驗組和陽性抗體對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組和陽性抗體對照組條帶的光密度值差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(見附圖5-1、附圖5-2、附圖5-3和附表4)
　　 結(jié)論：
　　 1.高糖可使人晶狀體上皮細(xì)胞株(SRA01/04)iNOS表達(dá)增加，并呈明顯的濃