腫瘤微環(huán)境中IL-6-STAT3信號通路對骨髓間充質干細胞惡性轉變的作用.pdf

1、目的：
　　通過骨髓間充質干細胞(MSCs)與C6膠質瘤細胞間接共培養(yǎng)，探討C6膠質瘤微環(huán)境中IL-6/STAT3信號通路的過度激活和表達對于MSCs向腫瘤方向轉化的影響。為在腫瘤治療過程中骨髓間充質干細胞的安全使用及為避免骨髓間充質干細胞惡性轉變藥物的探尋提供前期實驗基礎。
　　材料與方法：
　　1.實驗動物
　　本實驗所需的腫瘤細胞即大鼠的C6膠質瘤細胞，教育部重點實驗室兒科研究所腫瘤研究室（隸屬于重慶醫(yī)科大

2、學附屬兒童醫(yī)院）提供。
　　2.細胞來源
　　本次實驗所需的Wistar大鼠和新生鼠（其中大鼠體重為40±10g且為無特殊病原體動物SPF級別），均由大坪醫(yī)院動物醫(yī)學中心（隸屬于第三軍醫(yī)大學）購得，其合格證號為[SCXK（軍）2002-003]。
　　3.實驗分組和共培養(yǎng)3.1間接共培養(yǎng)體系的構建本實驗采用間接共培養(yǎng)體系的構建方式，其具體方法為把裝載或培養(yǎng)有C6膠質瘤細胞或星型膠質細胞的transwell小室插入6孔板

3、中，進而小室及其所載細胞便懸室6孔板中培養(yǎng)孔上，以便實驗組的C6膠質瘤外環(huán)境及其正常對照細胞星型膠質細胞的外環(huán)境中的細胞因子及其它分泌性蛋白可透過小室濾過膜進入其下方的6孔板的孔中，其相應的細胞卻不能透過6孔板的孔中，而懸有小室的6孔板的孔中種植有骨髓間充質干細胞，這樣便達到了間接共培養(yǎng)的目的。將小孔上下兩種細胞的比例進行調整，使其以上下相等的比例或細胞數(shù)進行間接共培養(yǎng)。
　　3.2實驗分組本研究共分為4個組，分別設有實驗組，陽性

4、對照組，陰性對照組及空白組。其中將骨髓間充質干細胞與C6膠質細胞共培養(yǎng)組設為實驗組，將C6膠質瘤細胞的常規(guī)培養(yǎng)組設為陽性對照組，將骨髓間充質干細胞與星型膠質細胞共培養(yǎng)組設為陰性對照組，將骨髓間充質干細胞的常規(guī)培養(yǎng)組設為空白組。
　　4.實驗方法
　　4.1采用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)學改變。
　　4.2檢測各組細胞細胞周期的改變。
　　4.3采用RT-qPCR及WB檢測各組細胞STAT3，GP130，IL

5、-6R，MDM2及BCL-xl的表達情況。
　　4.4采用免疫熒光檢測STAT3和GP130的表達情況。
　　4.5將各組共培養(yǎng)后的MSCs種植裸鼠被下，觀察腫瘤生長情況及采用HE染色檢查各組組織的瘤化情況，同時用免疫組化的方法檢測STAT3的表達情況。
　　4.6通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中的IL-6及IL-6R的表達情況。
　　結果：
　　1.通過倒置相差顯微鏡的觀查，經過共培養(yǎng)后的骨髓間充質干細胞的

6、生長特點發(fā)生明顯改變，同時具有了C6膠質瘤的生長性能，在腫瘤微環(huán)境中培養(yǎng)3-4周之后骨髓間充質干細胞成長梭狀生長，且細胞排列緊密，細胞更新明顯加快。
　　2.通過ELISA法檢測細胞上清液中的IL-6及IL-6R時發(fā)現(xiàn)，經與C6共培養(yǎng)組的IL-6及IL-6R的表達明顯增多。
　　3.通過流式細胞術檢測各組細胞周期發(fā)現(xiàn)，經與C6共培養(yǎng)后的MSCs增殖情況明顯增強。
　　4.通過激光共聚焦檢測到經與C6共培養(yǎng)后的MSCs細

7、胞其GP13P，STAT3及P-STAT3處于明顯高表達，與對照組比，有顯著統(tǒng)計學意義。
　　5.通過Western及PCR發(fā)現(xiàn)實驗組的骨髓間充干細胞中不僅STAT3表達增多，同時細胞內STAT3的下游相關蛋白也表達增多，如MDM2和CyclinD1。
　　6.將各組細胞種植于裸鼠體內后發(fā)現(xiàn)，經與C6共培養(yǎng)后的MSCs種植裸鼠體內后其腫瘤增殖與對照組相比，有明顯統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　MSCs的惡性轉變與S