腫瘤微環(huán)境中IL-6-STAT3信號通路對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的作用.pdf

1、目的：
　　通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞間接共培養(yǎng)，探討C6膠質(zhì)瘤微環(huán)境中IL-6/STAT3信號通路的過度激活和表達(dá)對于MSCs向腫瘤方向轉(zhuǎn)化的影響。為在腫瘤治療過程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的安全使用及為避免骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變藥物的探尋提供前期實驗基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1.實驗動物
　　本實驗所需的腫瘤細(xì)胞即大鼠的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，教育部重點實驗室兒科研究所腫瘤研究室（隸屬于重慶醫(yī)科大

2、學(xué)附屬兒童醫(yī)院）提供。
　　2.細(xì)胞來源
　　本次實驗所需的Wistar大鼠和新生鼠（其中大鼠體重為40±10g且為無特殊病原體動物SPF級別），均由大坪醫(yī)院動物醫(yī)學(xué)中心（隸屬于第三軍醫(yī)大學(xué)）購得，其合格證號為[SCXK（軍）2002-003]。
　　3.實驗分組和共培養(yǎng)3.1間接共培養(yǎng)體系的構(gòu)建本實驗采用間接共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方式，其具體方法為把裝載或培養(yǎng)有C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞或星型膠質(zhì)細(xì)胞的transwell小室插入6孔板

3、中，進而小室及其所載細(xì)胞便懸室6孔板中培養(yǎng)孔上，以便實驗組的C6膠質(zhì)瘤外環(huán)境及其正常對照細(xì)胞星型膠質(zhì)細(xì)胞的外環(huán)境中的細(xì)胞因子及其它分泌性蛋白可透過小室濾過膜進入其下方的6孔板的孔中，其相應(yīng)的細(xì)胞卻不能透過6孔板的孔中，而懸有小室的6孔板的孔中種植有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，這樣便達(dá)到了間接共培養(yǎng)的目的。將小孔上下兩種細(xì)胞的比例進行調(diào)整，使其以上下相等的比例或細(xì)胞數(shù)進行間接共培養(yǎng)。
　　3.2實驗分組本研究共分為4個組，分別設(shè)有實驗組，陽性

4、對照組，陰性對照組及空白組。其中將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與C6膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組設(shè)為實驗組，將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)組設(shè)為陽性對照組，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組設(shè)為陰性對照組，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)組設(shè)為空白組。
　　4.實驗方法
　　4.1采用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。
　　4.2檢測各組細(xì)胞細(xì)胞周期的改變。
　　4.3采用RT-qPCR及WB檢測各組細(xì)胞STAT3，GP130，IL

5、-6R，MDM2及BCL-xl的表達(dá)情況。
　　4.4采用免疫熒光檢測STAT3和GP130的表達(dá)情況。
　　4.5將各組共培養(yǎng)后的MSCs種植裸鼠被下，觀察腫瘤生長情況及采用HE染色檢查各組組織的瘤化情況，同時用免疫組化的方法檢測STAT3的表達(dá)情況。
　　4.6通過ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-6及IL-6R的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.通過倒置相差顯微鏡的觀查，經(jīng)過共培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的

6、生長特點發(fā)生明顯改變，同時具有了C6膠質(zhì)瘤的生長性能，在腫瘤微環(huán)境中培養(yǎng)3-4周之后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成長梭狀生長，且細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞更新明顯加快。
　　2.通過ELISA法檢測細(xì)胞上清液中的IL-6及IL-6R時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)與C6共培養(yǎng)組的IL-6及IL-6R的表達(dá)明顯增多。
　　3.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，經(jīng)與C6共培養(yǎng)后的MSCs增殖情況明顯增強。
　　4.通過激光共聚焦檢測到經(jīng)與C6共培養(yǎng)后的MSCs細(xì)

7、胞其GP13P，STAT3及P-STAT3處于明顯高表達(dá)，與對照組比，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.通過Western及PCR發(fā)現(xiàn)實驗組的骨髓間充干細(xì)胞中不僅STAT3表達(dá)增多，同時細(xì)胞內(nèi)STAT3的下游相關(guān)蛋白也表達(dá)增多，如MDM2和CyclinD1。
　　6.將各組細(xì)胞種植于裸鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)與C6共培養(yǎng)后的MSCs種植裸鼠體內(nèi)后其腫瘤增殖與對照組相比，有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　MSCs的惡性轉(zhuǎn)變與S