EFEMP1通過Wnt-β-catenin信號通路調(diào)控子宮內(nèi)膜癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌（內(nèi)膜癌）是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。傳統(tǒng)的二分類法依據(jù)ERα表達情況將其分為I型（ERα表達陽性，雌激素依賴，分化好，對孕激素治療有良好反應，預后較好）和II型（ERα表達陰性，非雌激素依賴，分化差，對孕激素治療反應不良，預后較差）。然而，有高達20％的I型內(nèi)膜癌復發(fā)，更有50%的II型內(nèi)膜癌不復發(fā)。此外部分I型內(nèi)膜癌對孕激素治療無反應且預后較差，而少數(shù)II型內(nèi)膜癌在孕激素治療中卻會出乎意料的發(fā)生反應且預后也較好?；趦?/p>

2、者在臨床上存在相當程度的交叉重疊現(xiàn)象，其在內(nèi)膜癌治療及診斷預后中的價值受到限制。因而，加強內(nèi)膜癌發(fā)生及進展的基礎(chǔ)研究，對內(nèi)膜癌復發(fā)及轉(zhuǎn)移進行早期預測、診斷及預后評估等是內(nèi)膜癌研究的前沿課題，對于提高內(nèi)膜癌患者生存率具有重要科學意義。
　　EFEMP1(Epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein1)屬于Fibulin家族的細

3、胞外糖蛋白，其發(fā)揮致癌基因或抑癌基因作用根據(jù)腫瘤微環(huán)境而不同。其中在女性惡性腫瘤中，研究結(jié)果也存在差異。宮頸癌中證實通過促微血管形成導致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力增強。而在另一雌激素依賴性腫瘤乳腺癌的研究中，EFEMP1在腫瘤組織中表達下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用。然而內(nèi)膜癌中EFEMP1的作用尚未明確。
　　本課題擬從四個方面進行研究：
　?。?）檢測內(nèi)膜癌細胞及組織樣本中EFEMP1的表達，并分析其與病理參數(shù)的關(guān)系；
　?。?）

4、探討EFEMP1啟動子區(qū)CpG島甲基化與內(nèi)膜癌中EFEMP1表達下調(diào)的關(guān)系；
　?。?）通過上調(diào)及下調(diào)EFEMP1表達，體內(nèi)外檢測其對內(nèi)膜癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響；
　?。?）進一步探討內(nèi)膜癌中EFEMP1基因在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的作用及潛在機制。
　　第一部分 EFEMP1在子宮內(nèi)膜癌組織及細胞系中的表達
　　目的：檢測內(nèi)膜癌細胞株及組織標本中EFEMP1的表達水平，分析與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

5、　　方法：利用熒光定量 PCR及 Westernblot方法檢測內(nèi)膜癌細胞株 Iskhikawa，RL95-2，AN3CA，KLE，SPEC-2，HEC-1B中EFEMP1mRNA及蛋白水平的表達；免疫組織化學的方法檢測人正常子宮內(nèi)膜，不典型增生內(nèi)膜及內(nèi)膜癌中EFEMP1表達，并通過免疫組織化學半定量評分分析EFEMP1表達水平及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　（1）細胞系中表達：與原代培養(yǎng)的正常子宮內(nèi)膜細胞相比，I

6、skhikawa,RL95-2,AN3CA,KLE,SPEC2,HEC-1B細胞中EFEMP1mRNA表達量分別為正常內(nèi)膜上皮細胞的15.1%,61.2%,16.5%,43.61%,0.56%,0.48%,均P<0.05;通過Western blot檢測其在蛋白水平表達也顯著降低。
　?。?）組織中表達：通過免疫組化半定量評分分析顯示EFEMP1表達陽性率在正常子宮內(nèi)膜中為(32/40)80%，不典型增生內(nèi)膜為(7/10)70%，

7、內(nèi)膜癌為(16/84)19%，在內(nèi)膜癌組織中表達顯著降低。
　　（3）與病理參數(shù)關(guān)系：EFEMP1陽性表達率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性內(nèi)膜癌中為3.7%(1/27)，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性內(nèi)膜癌中為26.3%(15/57)，兩者呈負相關(guān)，P=0.014。
　　結(jié)論：EFEMP1在內(nèi)膜癌細胞及組織中表達降低，且與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示EFEMP1可能抑制內(nèi)膜癌的惡性進展。
　　第二部分內(nèi)膜癌中EFEMP1基因啟動子區(qū)域表觀遺傳學

8、改變
　　目的：探討EFEMP1啟動子高甲基化與內(nèi)膜癌中表達降低的關(guān)系。
　　方法：應用甲基化特異性PCR(MSP)檢測各株內(nèi)膜癌細胞、新鮮冰凍正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌組織中EFEMP1啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)；亞硫酸鹽修飾后測序(BSP)檢測樣本中EFEMP1基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化概率；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷即5-aza-dC）及組蛋白去乙?；敢种芓richostatin A(TSA)處

9、理內(nèi)膜癌細胞，檢測EFEMP1啟動子區(qū)域甲基化水平，熒光定量PCR及Western blot檢測EFEMP1表達變化。
　　結(jié)果：
　?。?）MSP：內(nèi)膜癌組織中發(fā)生EFEMP1啟動子區(qū)域甲基化概率為67%(65/97)，明顯高于正常內(nèi)膜組織10%(4/40)；在6株子宮內(nèi)膜癌細胞中HEC-1B,SPEC2，AN3CA細胞中檢測到EFEMP1啟動子區(qū)域的甲基化條帶，并且EFEMP1表達水平顯著低于未檢測到EFEMP1甲基化的

10、RL95-2及KLE細胞。
　　（2）免疫組織化學半定量評分分析43例內(nèi)膜癌組織不同甲基化狀態(tài)下EFEMP1蛋白表達水平，EFEMP1表達下降與其啟動子甲基化負相關(guān)，P=0.03。
　?。?）5-aza-dC及 TSA處理EFEMP1啟動子區(qū)域甲基化的HEC-1B、SPEC-2及AN3CA內(nèi)膜癌細胞株，可逆轉(zhuǎn)EFEMP1表達水平及甲基化狀態(tài)。
　?。?）BSP：亞硫酸鹽修飾后測序免疫組化半定量評分不同的內(nèi)膜癌組織及5-

11、aza-dC、TSA處理前后內(nèi)膜癌細胞EFEMP1啟動子區(qū)域CpG島甲基化概率，HEC-1B及RL95-2細胞CpG島甲基化概率分別為86.7%及5.3%；非甲基化的正常子宮內(nèi)膜(N1)及內(nèi)膜癌組織(T3)甲基化概率分別為0%及3.3%；內(nèi)膜癌中免疫組化評分高組織伴隨EFEMP1甲基化水平低，而內(nèi)膜癌免疫組化評分低的組織EFEMP1甲基化概率高。
　　結(jié)論：在子宮內(nèi)膜癌中EFEMP1基因啟動子GpG島高甲基化導致其表達水平降低。<

12、br>　　第三部分EFEMP1對內(nèi)膜癌細胞生物學行為的影響
　　目的：探索EFEMP1對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、侵襲、遷移及體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　方法：在子宮內(nèi)膜癌細胞中轉(zhuǎn)染干擾及過表達EFEMP1質(zhì)粒，通過MTT、平板克隆實驗、Transwell及劃痕實驗對各組細胞分別進行增殖、侵襲、遷移能力檢測；構(gòu)建過表達EFEMP1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株通過裸鼠荷瘤實驗檢測EFEMP1對內(nèi)膜癌細胞致瘤能力的作用。
　　結(jié)果：
　　(1

13、)轉(zhuǎn)染效果檢測：HEC-1B細胞轉(zhuǎn)染EFEMP1過表達質(zhì)粒，通過G418加壓篩選構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，EFEMP1mRNA水平上調(diào)約500倍(P<0.01)；KLE細胞瞬時轉(zhuǎn)染EFEMP1小干擾RNA，下調(diào)效率為75%；RL95-2細胞轉(zhuǎn)染EFEMP1干擾質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株，EFEMP1 mRNA水平下調(diào)90%。
　　(2)細胞增殖：細胞干擾EFEMP1表達后培養(yǎng)第4天顯著促進RL95-2細胞增殖；細胞過表達EFEMP1后第4天開始顯著抑制

14、細胞增殖。
　　(3)侵襲及遷移：與對照組相比，轉(zhuǎn)染過表達EFEMP1質(zhì)粒的HEC-1B細胞穿過小室的數(shù)量明顯減少(P<0.05)，遷移能力降低；干擾 EFEMP1表達的RL95-2及KLE細胞穿過小室數(shù)量顯著增多，其遷移能力也明顯增強（P<0.05）。
　　(4)內(nèi)膜癌細胞中EFEMP1可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2和9的分泌，降低腫瘤侵襲能力(P＜0.05)。
　　(5)HEC-1B細胞過表達EFEMP1可降低裸鼠成瘤能力

15、，腫瘤體積及重量較對照組降低，Ki-67表達降低(P<0.01)。
　　結(jié)論：EFEMP1在子宮內(nèi)膜癌細胞中發(fā)揮抑癌基因作用。
　　第四部分EFEMP1通過Wnt/β-catenin通路影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程
　　目的：探討EFEMP1對內(nèi)膜癌EMT過程的調(diào)控及相關(guān)信號通路探討。
　　方法：免疫組織化學檢測正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜及內(nèi)膜癌中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin、S

16、nail及β-catenin表達水平，并分析與EFEMP1表達的相關(guān)性；子宮內(nèi)膜癌細胞株中過表達及干擾EFEMP1表達檢測EMT相關(guān)指標的變化；通過TGF-β誘導EMT，檢測EFEMP1在EMT發(fā)生過程中的作用；利用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑及激動劑作用內(nèi)膜癌細胞株，檢測EFEMP1在內(nèi)膜癌中影響EMT過程的相關(guān)信號通路；通過裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移模型驗證EFEMP1對內(nèi)膜癌細胞遠處轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果：
　　（1）與

17、正常子宮內(nèi)膜組織相比，內(nèi)膜癌中E-cadherin表達顯著降低，而Vimentin、Snail及β-catenin表達明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義。
　?。?）內(nèi)膜癌中EFEMP1表達與E-cadherin呈正相關(guān)（r=0.499，P<0.001），與Vimentin、Snail及β-catenin表達呈負相關(guān)（r=-0.164，-0.369，-0.299）。
　?。?）HEC-1B細胞中過表達EFEMP1上調(diào)E-cadhe

18、rin，下調(diào)Vimentin、Snail、β-catenin的表達；相反RL95-2細胞中干擾EFEMP1表達下調(diào)上皮性標志物，上調(diào)間質(zhì)性標志物的表達。
　　（4）TGF-β誘導EMT過程中，過表達EFEMP1抑制細胞形態(tài)由上皮性形態(tài)立方形向間質(zhì)性形態(tài)如長梭形、偽足形成等轉(zhuǎn)變；而干擾EFEMP1可促進細胞向間質(zhì)形態(tài)的轉(zhuǎn)變。
　?。?）過表達EFEMP1可抑制Wnt信號通路下游靶基因Cyclin-D1及c-Myc表達，而干擾E