胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)受損子宮內(nèi)膜

1、中國組織工程研究 第 21 卷 第 13 期 2017–05–08 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research May 8, 2017 Vol.21, No.13P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 2074·研究原著·www.CRTER.org牛婷，女，1990 年生，安徽省淮北市

2、人，漢族，武漢大學(xué)人民醫(yī)院在讀碩士，主要從事生殖內(nèi)分泌及不孕不育等方面的研究。通訊作者：李愛斌，博士，主任醫(yī)師，武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖中心，湖北省武漢市 430060中圖分類號(hào):R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):2095-4344(2017)13-02074-07稿件接受：2016-12-09Niu Ting, Studying for master’s degree, Reproductive Medical Center, Ren

3、min Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, ChinaCorresponding author:Li Ai-bin, M.D., Chief physician, Reproductive Medical Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,

4、China實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性 SD 大鼠。造模 造模：熱損傷法建立子宮內(nèi)膜損傷模型。分組干預(yù) 分組干預(yù)：宮腔移植組：宮腔局部注射同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞懸液 1 mL；宮腔對(duì)照組：宮腔注射等量的PBS；尾靜脈移植組：尾靜脈注射同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞懸液 1 mL；尾靜脈對(duì)照組：尾靜脈注射等量PBS。觀察指標(biāo) 觀察指標(biāo)：于大鼠第 3 個(gè)動(dòng)情期時(shí)將造模雌鼠與雄鼠合籠，觀察陰栓，在觀察到陰栓的當(dāng)天處死造模大鼠，游離出子宮組織，進(jìn)行子宮

5、內(nèi)腺體計(jì)數(shù)、免疫組織化學(xué)及 Western blot 檢測。結(jié)果 結(jié)果：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞移植可不同程度地修復(fù)大鼠子宮內(nèi)膜損傷組織，增加子宮內(nèi)膜腺體計(jì)數(shù)，改善子宮內(nèi)膜容受性。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)受損子宮內(nèi)膜牛 婷，李愛斌，陳 力(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖中心，湖北省武漢市 430060)引用本文：牛婷，李愛斌，陳力. 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)受損子宮內(nèi)膜[J].中國組織工程研究，2017，21(13):2074-2080.DOI:10.39

6、69/j.issn.2095-4344.2017.13.018 ORCID: 0000-0001-6098-3289(牛婷)文章快速閱讀：文題釋義：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞：是成體干細(xì)胞的一種，來源豐富，標(biāo)本易于獲取，且可向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及肝細(xì)胞等方向分化，臨床應(yīng)用不存在免疫排斥、不涉及倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，因此被認(rèn)為是成體干細(xì)胞的理想來源，在骨組織修復(fù)、血管損傷領(lǐng)域及妊娠期高血壓疾病等方面均有關(guān)于胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。動(dòng)物及臨床研

7、究均顯示了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在現(xiàn)代細(xì)胞治療領(lǐng)域及組織工程領(lǐng)域的巨大潛力。整合素 αvβ3：整合素是由 α、β 亞單位組成的細(xì)胞表面受體，αvβ3 在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)很重要。Lessey 等發(fā)現(xiàn) αvβ3 表達(dá)在排卵后的黃體中期的子宮內(nèi)膜，早孕的蛻膜中也存在，與“著床窗”的時(shí)間相吻合。有研究者對(duì)行試管助孕患者的子宮內(nèi)膜進(jìn)行活檢，然后檢測子宮內(nèi)膜組織 ανβ3 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示 ανβ3表達(dá)較高的患者妊娠率也更高，很多研究表明整合素是子宮

8、內(nèi)膜容受性的標(biāo)志之一，因而，ανβ3 的表達(dá)強(qiáng)度可以作為評(píng)價(jià)修復(fù)效果的指標(biāo)之一。摘要背景：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞來源豐富，易于獲取，可向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及肝細(xì)胞等方向分化，臨床應(yīng)用不存在免疫排斥、不涉及倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，因此被認(rèn)為是成體干細(xì)胞的理想來源。目的：觀察同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠子宮內(nèi)膜損傷的情況。方法：取雌性 SD 大鼠，通過熱損傷法建立子宮內(nèi)膜損傷模型，造模后第 15 天，將造模成功的 40 只大鼠隨機(jī)分為 4 組，宮

9、腔移植組于宮腔局部注射同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞懸液 1 mL，宮腔對(duì)照組于宮腔注射等量的 PBS，尾靜脈移植組于尾靜脈注射同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞懸液 1 mL，尾靜脈對(duì)照組于尾靜脈注射等量 PBS。于大鼠第 3 個(gè)動(dòng)情期時(shí)將造模雌鼠與雄鼠合籠，觀察陰栓，在觀察到陰栓的當(dāng)天處死造模大鼠，游離出子宮組織，進(jìn)行子宮內(nèi)腺體計(jì)數(shù)、免疫組織化學(xué)及 Western blot 檢測。結(jié)果與結(jié)論：①腺體計(jì)數(shù)：宮腔移植組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量多于其余 3 組(

10、P < 0.05)，尾靜脈移植組多于宮腔對(duì)照組、尾靜脈對(duì)照組(P < 0.05)；②子宮內(nèi)膜整合素 αVβ3 表達(dá)：免疫組織化學(xué)及 Western blot 檢測均顯示宮腔移植組整合素 αVβ3 強(qiáng)于其余 3 組(P < 0.05)，尾靜脈移植組多于宮腔對(duì)照組、尾靜脈對(duì)照組(P < 0.05)；③結(jié)果表明：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞移植可不同程度地修復(fù)大鼠子宮內(nèi)膜損傷組織，增加子宮內(nèi)膜腺體計(jì)數(shù)，改善子宮內(nèi)膜容受性。關(guān)鍵詞：

11、干細(xì)胞；移植；胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；子宮內(nèi)膜損傷；修復(fù)；ανβ3；湖北省自然科學(xué)基金主題詞：干細(xì)胞移植；子宮內(nèi)膜；胎盤；整合素 αVβ3；組織工程基金資助：湖北省自然科學(xué)基金(2014CFB206)縮略語：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞：placental mesenchymal stem cells，PMSCsThe use of placental mesenchymal stem cells to repair the damaged endome

12、trium Niu Ting, Li Ai-bin, Chen Li (Reproductive Medical Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China)同種異體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠子宮內(nèi)膜損傷牛婷，等. 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)受損子宮內(nèi)膜P.O. Box 10002, Shenyang 110180

13、 www.CRTER.org 2076www.CRTER.orgDawley(SD)大鼠各數(shù)只，體質(zhì)量200 g左右，SPF級(jí)別，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SYXK(鄂)2015-0027，實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：PMSCs細(xì)胞由武漢大學(xué)2012級(jí)碩士研究生曹景云所贈(zèng)。主要試劑：DMEM培養(yǎng)液(美國HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；二甲基亞砜(Sigma公司)；免疫組化試劑盒、一抗兔抗

14、鼠ανβ抗體、二抗羊抗兔IgG抗體(Bioss公司)；蘇木精-伊紅染色試劑盒(百浩生物科技公司)；DAB染色劑(武漢博士德)；BAC蛋白濃度測定試劑盒(美國Pierce公司)。1.4 實(shí)驗(yàn)方法大鼠子宮內(nèi)膜損傷的模型制備：按照曲軍英等[10]的熱損傷的原理方法來制備大鼠子宮內(nèi)膜損傷的模型，具體步驟如下：取90只SD大鼠電子稱重器來稱質(zhì)量，按100 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉；待小鼠完全麻醉后，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒皮膚，捫及膀胱

15、，在其上方縱行剪開2.0 cm切口，找到子宮，緩慢挑出；10 mL注射器抽取于8 mL 80 ℃預(yù)熱生理鹽水，取“Y”型子宮一側(cè)(取左側(cè))近左右兩側(cè)子宮匯合處，用10 mL注射器針頭穿入子宮后，展平子宮，待其在子宮腔內(nèi)穿行約 3 cm后，將針頭從另一側(cè)宮腔刺出，出后接一皮管，將熱水導(dǎo)入廢液缸中；然后用同樣方法熱損傷其他大鼠子宮內(nèi)膜組織，熱水推畢后，緩慢拔出注射器針頭，整平并復(fù)位子宮，生理鹽水沖洗腹腔；無菌針線縫合腹部皮膚及皮下組織，轉(zhuǎn)移

16、至干凈鼠籠，苦味酸做好記號(hào)，記錄日期，待其麻醉清醒后，送回動(dòng)物房；硫酸慶大霉素(8 IU 2 mL/支稀釋成1 000 U/mL)術(shù)后連續(xù)3 d腹腔內(nèi)注射2 mL稀釋后的慶大霉素。模型制備后 1，2，7， 14 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)斷頸處死10只大鼠，縱向剪開腹壁，找到大鼠子宮，觀察并記錄處理后的情況，剪取處理側(cè)子宮組織0.5 cm，40 g/L多聚甲醛固定24 h；然后用PBS清洗，放于包埋器內(nèi)，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、蘇木精-伊紅染

17、色步驟，正置顯微鏡下觀察結(jié)果并進(jìn)行拍照。將子宮內(nèi)膜處理后15 d的10只大鼠與雄鼠合籠，大鼠與雄鼠在17：00合籠，雌、雄比例 3∶1，孕12 d時(shí)處死孕鼠，觀察雙側(cè)子宮受孕情況。若實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡，則以同樣方法重新造模增補(bǔ)。分組干預(yù)：造模后第15天，將造模成功的剩余40只雌性SD大鼠隨機(jī)分4組干預(yù)，每組10只：宮腔移植組沿原切口打開腹腔，挑出左側(cè)內(nèi)膜損傷側(cè)子宮，用1 mL注射器取1×1010 L-1的第3代PMSCs細(xì)

18、胞懸液1 mL，將細(xì)胞懸液緩慢注射至宮腔內(nèi)，留針20 s，以利于細(xì)胞彌散，復(fù)位子宮， 1 mL生理鹽水沖洗腹腔，逐層關(guān)腹，將大鼠移至37 ℃恒溫板上，麻醉醒后送回動(dòng)物房，并進(jìn)行標(biāo)記；宮腔對(duì)照組按照宮腔移植組方式在宮腔注射等量的PBS；尾靜脈移植組于尾靜脈注射1×1010 L-1的第3代PMSCs細(xì)胞懸液1 mL；尾靜脈對(duì)照組于尾靜脈注射等量PBS。1.5 主要觀察指標(biāo)細(xì)胞移植后取材及觀察：細(xì)胞移植后，通過陰道脫落

19、細(xì)胞學(xué)檢查，觀察大鼠的動(dòng)情周期，在第3個(gè)動(dòng)情周期的動(dòng)情期將造模鼠與雄鼠合籠，通過觀察陰栓來確定雌雄鼠是否交配，在觀察陰栓到陰栓后的當(dāng)天，處死造模雌鼠，游離出子宮組織，通過子宮內(nèi)膜腺體恢復(fù)情況、測定整合素ανβ3的表達(dá)檢測細(xì)胞移植后受損子宮內(nèi)膜的修復(fù)情況。圖 1 SD 大鼠正常子宮內(nèi)膜組織及熱損傷子宮內(nèi)膜組織(蘇木精-伊紅染色，×200)Figure 1 Normal or damaged endometrium in Sp

20、rague-Dawley rats (hematoxylin-eosin staining, ×200)圖注：圖中 A 為大鼠子正常宮內(nèi)膜組織；B 為熱損傷造模后第 1 天，內(nèi)膜間質(zhì)充血、水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張，其內(nèi)可見大量紅細(xì)胞；C 為熱損傷造模后第 2 天，內(nèi)膜間質(zhì)仍有血管充血，宮腔內(nèi)可見脫落的子宮內(nèi)膜組織碎片，子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)模糊、紊亂；D 為熱損傷造模后第 7天，子宮內(nèi)膜層變薄，腺體萎縮、變小，部分宮腔腔上皮內(nèi)膜處中斷；E

21、 為熱損傷造模后第 14 天，子宮腔變小，正常的內(nèi)膜組織較少，部分組織開始纖維化，顯示為較多紅色組織。A BC D EA BC D圖 2 建立 SD 大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型Figure 2 Establishing animal models of endometrial damage in Sprague-Dawley rats圖注：圖中 A 為大鼠正常子宮解剖，B 為挑出左側(cè)子宮組織，C 為 80 ℃熱水持續(xù)通過注射器針頭熱損傷子