骨髓間充質(zhì)干細胞抑制自體移植靜脈內(nèi)膜增生的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的：自體靜脈移植(autologous vein grafting，AVG)是治療冠狀動脈及周圍動脈缺血的重要方法。但是它的長期通暢率仍然受靜脈橋病變?nèi)鐒用}硬化，斑塊形成的顯著影響。文獻報道靜脈移植術(shù)后的前兩年約有20％-40％的患者會出現(xiàn)橋血管腔狹窄，故預(yù)防靜脈移植后再狹窄及提高遠期通暢率已成為當(dāng)今心血管病防治研究的一個重要方向。 研究表明靜脈移植后再狹窄的病理機制是以血管內(nèi)皮損傷作為始動環(huán)節(jié)的，隨后是巨噬細胞的粘

2、附和浸潤，以及平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移和過度增殖。盡管與冠狀動脈粥樣硬化疾病和血管成形術(shù)后再狹窄在病因及流行病學(xué)上有所不同，但是靜脈橋移植后再狹窄和前兩者具有一個共同的病理生理學(xué)階段：即內(nèi)皮完整性被破壞和新生內(nèi)膜的形成(新生內(nèi)膜的主要成分是過度增生的平滑肌細胞)。因此如何保護血管內(nèi)皮或者早期恢復(fù)損傷的內(nèi)皮功能，成為目前研究的重點。 干細胞(stem cell)是當(dāng)今器官和組織修復(fù)研究的熱點，它是一類具有自我復(fù)制和分化潛能的未分化細胞

3、，在適宜的條件下，可以分化為不同類型的具有特征性形態(tài)、特異分子標(biāo)志和特殊功能的成熟細胞。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，成體中的干細胞具有可塑性，在特定的條件下可跨系統(tǒng)、跨胚層分化為其它組織的細胞，稱為橫向分化。成體干細胞中研究最廣泛的是骨髓中的造血干細胞和間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs在體內(nèi)外不同的微環(huán)境中可以被誘導(dǎo)分化為多種細胞。由于BMSCs

4、具有易于分離培養(yǎng)和體外擴增，并可自體移植無免疫排斥反應(yīng)的特點，因此利用BMSCs的橫向分化潛能，可以根據(jù)需要將其誘導(dǎo)分化為特定的組織細胞，用以修復(fù)受損的組織或器官。已有大量證據(jù)表明骨髓起源的前體細胞或者干細胞能促進缺血組織的血管新生和梗死心肌的再生。 本研究的目的是通過將BMSCs經(jīng)血管移植到袖套管法建立的大鼠AVG模型中，觀察BMSCs移植后向向血管內(nèi)皮分化的情況，以及對靜脈橋血管新生內(nèi)膜形成的影響，探討B(tài)MSCs移植預(yù)防靜脈

5、橋移植物再狹窄的可行性。 方法：采用體重為100g左右的雄性Wistar大鼠用于分離和獲取BMSCs。首先通過貼壁培養(yǎng)法從供體大鼠骨髓中分離BMSCs，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)3代；觀察不同培養(yǎng)時間的細胞形態(tài)，并用流式細胞儀檢測表達CD90、CD44、CD34、CD45的陽性細胞數(shù)，以鑒定BMSCs的表型。然后經(jīng)促進內(nèi)皮生長分化的細胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)，體外觀察BMSCs向內(nèi)皮方向的分化。移植前用二氨基苯基吲哚(

6、DAPI)標(biāo)記細胞。 采用體重250-300g雄性Wistar大鼠作為AVG模型動物。將AVG模型動物分為三組(每組各26只)：正常對照組、AVG模型組和BMSCs移植組。取大鼠左側(cè)頸外靜脈2cm上下倒置后用袖套管法將其移植到同側(cè)的頸總動脈，制作AVG動物模型。AVG術(shù)后立即將標(biāo)記的BMSCs通過尾靜脈注射移植到體內(nèi)。分別于移植后的2w和4w取靜脈移植物，通過CD31和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)免疫熒光染色來觀察移植細胞的存

7、活以及分化為內(nèi)皮細胞的情況；通過Real-time PCR和western blot分析eNOS和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，來檢測內(nèi)皮功能的恢復(fù)情況；并進行增殖細胞核抗原(PCNA)免疫組織化學(xué)染色及HE染色觀察移植后新生內(nèi)膜增生情況，計算新生內(nèi)膜、平滑肌層的厚度。分析各組之間各項指標(biāo)的統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論：利用袖套管法建立大鼠頸外靜脈到頸總動脈的移植模型，手術(shù)簡便易行，成功率高，死亡率低。BMSCs在體外經(jīng)多種促內(nèi)皮

8、生長分化的細胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)可分化為內(nèi)皮細胞；BMSCs的移植可以促進AVG術(shù)后移植靜脈橋血管的早期再內(nèi)皮化，改善內(nèi)皮細胞的功能，抑制內(nèi)膜的過度增生。因此BMSCs移植可能成為防治AVG術(shù)后早期再狹窄的一個新的治療手段。 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的提取、分離培養(yǎng)和體外擴增的最佳條件，觀察在體外培養(yǎng)BMSCs向內(nèi)皮分化的能力，為進一

9、步促進自體移植血管橋內(nèi)皮細胞的損傷修復(fù)研究提供理想的移植供體細胞。 方法：通過貼壁培養(yǎng)法從成年大鼠骨髓中分離BMSCs，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)擴增；觀察不同培養(yǎng)時間的細胞形態(tài)，并通過流式細胞儀和免疫熒光染色檢測BMSCs的表型抗原。經(jīng)促內(nèi)皮生長分化的細胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)，體外觀察BMSCs向內(nèi)皮方向分化的潛能。 結(jié)論：用貼壁培養(yǎng)法可以對BMSCs進行分離培養(yǎng)和傳代擴增。在細胞因子誘導(dǎo)下，BMSCs可向內(nèi)皮細胞方

10、向分化。提示BMSCs是修復(fù)血管內(nèi)皮細胞理想的移植供體細胞。 目的：自體靜脈移植(autologous vein grafting，AVG)是治療冠狀動脈及周圍動脈缺血的重要方法，但移植后的內(nèi)膜增生所致的再狹窄嚴(yán)重地影響了遠期的療效。本研究擬將骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymalstem cells，BMSCs)移植到AVG大鼠模型中，觀察BMSCs在血管橋中向內(nèi)皮細胞分化的能力及對血

11、管橋新生內(nèi)膜形成的抑制作用，從而探討B(tài)MSCs移植預(yù)防AVG血管橋再狹窄的可行性。 方法：通過貼壁培養(yǎng)法從成年大鼠骨髓中分離純化BMSCs，移植前用DAPI標(biāo)記細胞。將左側(cè)頸外靜脈2cm上下倒置后用袖套管法移植到同側(cè)的頸總動脈制作AVG動物模型。BMSCs移植組即術(shù)后立即將標(biāo)記的細胞通過尾靜脈注射移植到體內(nèi)。按照上述方法將動物分為三組(每組26只)：(1)正常對照組，受體大鼠不進行自體靜脈移植和BMSCs移植。(2)AVG模型組

12、，受體大鼠只進行自體靜脈移植手術(shù)，術(shù)后不進行BMSCs移植。(3)BMSCs移植組，在進行自體靜脈移植后又進行BMSCs移植術(shù)。術(shù)后每組分兩批，分別于2w(14只)和4w(12只)處死，取出移植靜脈橋以備檢測。通過組織冰凍切片，進行CD31和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的免疫熒光染色，觀察移植細胞的存活、分化情況。通過Real-time PCR和western blot檢測移植靜脈中eNOS和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，分析