吲哚乙酸聯合辣根過氧化物酶對人涎腺腺樣囊性癌SACC-83細胞作用的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 涎腺腺樣囊性癌(Salivary Adenoid Cystic Carcinoma SACC)是較為常見的涎腺惡性腫瘤之一,占涎腺腫瘤的10％、涎腺惡性腫瘤的22％以及頭頸部惡性腫瘤的1％,好發(fā)于小涎腺及大涎腺中較小的腺體,手術治療是其主要的治療方法。但其侵襲性較強,易沿神經血管束向周圍擴散轉移,并可循血行遠處轉移到肺、肝、骨等組織,導致SACC患者術后生存率低,預后較差。因此尋找新的治療方法和有效抗癌藥物勢在

2、必行。
　　 植物激素在植物體內,作為執(zhí)行細胞通訊的化學信息在代謝、生長、形態(tài)形成等植物生理活動的各個方面均起著十分重要的作用。目前,有關植物激素抗腫瘤作用的研究取得了顯著成績。吲哚乙酸(indole-3-acetic,IAA)是一種植物生長激素,主要調節(jié)植物細胞的分化、生長和分裂增殖。辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是一種亞鐵血紅素酶,能氧化包括IAA在內的一系列底物。近年來的研究表明,I

3、AA的作用濃度取值不同,但HRP的濃度一定,IAA/HRP共同作用時具有抑制腫瘤細胞生長。并可誘導凋亡等作用,而當IAA和HRP以二者聯合作用時的相同濃度單獨作用時,則不會產生任何毒性效應。鑒于不同細胞對其敏感性存在差異,本研究選擇人涎腺腺樣囊性癌細胞系SACC-83進行實驗,觀察IAA/HRP對SACC-83細胞的作用,為了其治療SACC提供理論依據。
　　 目的:
　　 本研究擬采用經不同濃度的IAA/HRP處理過的

4、SACC-83細胞株進行檢測,觀察其對SACC-83細胞的生長抑制、細胞周期改變、抑癌基因及凋亡相關基因表達的影響,驗證IAA/HRP對SACC-83細胞的抑制作用,分析IAA/HRP抗腫瘤作用的可能機制；為IAA/HRP應用于SACC的臨床治療提供實驗依據。
　　 材料和方法：
　　 1 SACC-83細胞株由北京大學口腔醫(yī)學院惠贈。
　　 2 IAA和HRP購自Sigma公司。
　　 3光鏡觀察IAA

5、/HRP作用于SACC-83細胞后細胞的生長狀態(tài)及形態(tài)學改變。
　　 4采用CCK-8法檢測各組細胞的增殖抑制率:實驗分組(設調零組、對照組和實驗組),調零組只加培養(yǎng)基,對照組加細胞和培養(yǎng)基,實驗組按照IAA的濃度分別為20、40、60、80、100μmol/L五組,每組HRP的濃度均為1.2mg/L。測其作用于SACC-83細胞24h、48h、72h、96h后的OD值,并計算各組細胞的增殖抑制率。
　　 5采用流式細胞

6、儀檢測細胞周期的改變。
　　 6采用免疫細胞化學方法和Western blot檢測IAA/HRP對SACC-83細胞抑癌相關基因PTEN蛋白表達的改變。
　　 7實時熒光定量PCR(Real-time PCR)分析凋亡相關基因Caspase-3和Livina基因mRNA表達水平的改變。
　　 結果：
　　 1細胞形態(tài)對照組細胞生長較快,呈多邊形,排列成鋪路石狀。60μmol/LIAA與1.2mg/LHRP

7、組作用SACC-83細胞48后,細胞邊緣收縮,梭形細胞增多,核漿比例下降,核仁變小；試驗組中100μmol/LIAA與1.2mg/LHRP組作用SACC-83細胞48后細胞的形態(tài)變化更加明顯,并有部分細胞出現皺縮,變小變圓,空泡明顯。
　　 2 IAA/HRP對SACC-83細胞增殖的影響與對照組相比,除20μmol/L組無統(tǒng)計學意義外,40μmol/L濃度以上的IAA與HRP結合均可抑制SACC-83細胞的增殖,隨著濃度的增加

8、,細胞增殖能力下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且隨著時間的延長,其增殖能力也下降,其差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明IAA/HRP對SACC-83的抑制作用具有時間和濃度依賴性。
　　 3細胞周期分析與對照組相比,實驗組(60、100μmol/LIAA+1.2mg/LHRP)作用48h時,隨著IAA藥物濃度的增大,流式細胞儀檢測示G0/G1期細胞百分比呈上升趨勢,S期和G2/M期細胞百分比均呈下降趨勢,其差別均具

9、有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4免疫細胞化學結果分析濃度為60μmol/L和100μmol/L組實驗組的測量值均存在顯著差異(P<0.04),隨著IAA濃度的增加,PTEN的值增高明顯,說明IAA/HRP對SACC-83細胞的抑制具有濃度依賴性。
　　 5 Western blot檢測抑癌基因的表達100μmol/LIAA組在作用SACC-83細胞48h后,PTEN蛋白條帶增寬、含量明顯上升。
　　 6實

10、時熒光定量PCR檢測凋亡相關基因的表達不同濃度的IAA/HRP(60、100μmol/LIAA+1.2mg/LHRP)聯合作用可上調Caspase-3的mRNA表達(P<0.05),下調Livinα的mRNA的表達(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1 IAA/HRP體外對SACC-83細胞具有增殖抑制作用,且呈劑量和時間依賴性。
　　 2 IAA/HRP可引起SACC-83細胞周期阻滯,G0/G1期比值逐漸

11、增加,S期和G2/M期的比值逐漸降低,且存在劑量-效應關系。
　　 3 IAA/HRP對SACC-83細胞的增殖具有明顯的抑制作用,可通過上調抑癌基因PTEN蛋白的表達而實現。
　　 4 IAA/HRP可誘導人腺樣囊性癌SACC-83細胞凋亡,其作用機制是通過調節(jié)凋亡相關基因Caspase-3和Livina的表達而實現的。
　　 5細胞周期阻滯、調控凋亡相關基因Caspase-3和Livina及抑癌基因PTEN的