吲哚乙酸-辣根過氧化物酶對人涎腺腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展作用的實驗研究.pdf

1、涎腺腺樣囊性癌(Salivary Adenoid Cystic Carcinoma，SACC)來源于上皮，約占涎腺腫瘤的11％，在涎腺惡性腫瘤中占24％，男女發(fā)病率未見明顯差異性，好發(fā)年齡為40-60歲。SACC好發(fā)于小涎腺及大涎腺中較小的腺體，以腭腺、頜下腺和舌下腺多見，在腮腺腫瘤中僅占2％-3％。SACC對放化療均不敏感，其主要的治療方法仍然為手術(shù)治療，SACC侵襲性強，易沿神經(jīng)血管束向周圍組織擴散轉(zhuǎn)移，并可通過血運轉(zhuǎn)移至肺、腦、骨

2、、肝等組織，術(shù)后復(fù)發(fā)率為16％-85％，轉(zhuǎn)移率為25％-55％，其中肺部轉(zhuǎn)移率則高達70％-100％，所以患者的預(yù)后較差，術(shù)后生存率較低。
　　口腔頜面部惡性腫瘤容易造成嚴重的面部畸形和口咽功能障礙，患者承受著心理和生理的莫大痛苦。目前的治療方法主要以外科手術(shù)為主，放射治療和化學(xué)藥物治療為其輔助治療手段，三種手段各有特點，互為補充，其地位均無法被取代。越來越多的研究將三種方法有效的結(jié)合起來，發(fā)揮各自的優(yōu)點，規(guī)避其缺點，最大程度的減

3、輕患者的痛苦，避免腫物的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移?；瘜W(xué)藥物療法因其特殊性而得到研究者的青睞，由原來的細胞毒性藥物的研究，逐步轉(zhuǎn)向研究新型的抗腫瘤藥物，以期在惡性腫瘤的治療中掀開新的一頁。
　　植物激素是天然激素，也被稱為植物內(nèi)源激素，由植物自身代謝而產(chǎn)生。雖為簡單的小分子有機化合物，但卻能發(fā)揮較為獨特的作用，在較低濃度下就能對植物及動物產(chǎn)生明顯的影響。既往的研究主要集中在其對植物生長發(fā)育的影響方面，后來研究者發(fā)現(xiàn)某些植物激素對腫瘤細胞的生長和發(fā)

4、育也會產(chǎn)生較為明顯的影響，所以逐步將植物激素引入到對腫瘤的治療上來。1942年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了吲哚乙酸(Indole-acetic-acid，IAA)的抗腫瘤作用，遂將其從高等植物中分離出來，逐步開始了吲哚乙酸在惡性腫瘤領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。IAA是一種植物生長激素，主要參與并調(diào)節(jié)植物細胞的分裂、分化、生長等過程。辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)含有激素，可以氧化吲哚乙酸，是特殊的植物過氧化物酶。關(guān)于吲哚乙

5、酸和辣根過氧化物的研究始于1995年，越來越多的研究表明，IAA在人體內(nèi)的耐受性較高，不易被哺乳類過氧化物酶氧化，只有在HRP存在時，IAA才會發(fā)生明顯的氧化，并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，此代謝產(chǎn)物有毒性，但此毒性只對腫瘤細胞發(fā)生作用，對正常組織沒有危害。
　　本課題將從以下兩個部分通過實驗研究分別探討IAA/HRP對人腺樣囊性癌的作用，為腺樣囊性癌的防治提供新的思路。
　　第一部分:IAA/HRP對腺樣囊性癌細胞生物學(xué)行為的影響

6、>　　目的:
　　建立人腮腺腺樣囊性癌系PACC-1561，同時采用人涎腺腺樣囊性癌細胞株SACC-2細胞作為生物重復(fù)參考。通過對細胞增殖力、細胞周期分布和細胞凋亡等檢測來觀察IAA/HRP對SACC-2細胞和PACC-1561細胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　采用CCK-8法檢測指數(shù)生長期的細胞增殖情況，采用流式細胞儀分析細胞周期變化，按AnnexinⅤ--PE Apoptosis Kit操作手冊進行早期細胞凋

7、亡的檢測，利用RT-PCR檢測核因子NF-κBp65mRNA在腺樣囊性癌細胞中的表達，蛋白兔疫印跡檢測各組細胞中c-Myb蛋白的表達情況。
　　結(jié)果:
　　IAA/HRP抑制細胞增長，與對照組相比差異顯著(P＜0.01);流式細胞儀分析結(jié)果顯示IAA/HRP組細胞周期阻滯在G0-G1期;流式細胞儀檢測實驗組與對照組細胞的AnnexinⅤ-PE水平，實驗組細胞的凋亡率明顯升高;腺樣囊性癌細胞NF-κBp65mRNA在實驗組中的

8、相對表達量明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與陽性對照組5-Fu相比，未見明顯差異性;IAA/HRP作用于細胞后，上調(diào)抑癌基因Bax蛋白的表達，下調(diào)c-Myb蛋白的表達。
　　第二部分:IAA/HRP對裸鼠腺樣囊性癌細胞移植瘤生長抑制作用的實驗研究
　　目的:
　　進一步探討IAA/HRP對裸鼠腺樣囊性癌細胞移植瘤生長的抑制作用。
　　方法:
　　建立腺樣囊性癌SACC-2和PACC-1561荷瘤裸鼠模

9、型，將荷瘤裸鼠隨機分為3組，每組8只:空白對照組、5-Fu陽性對照組和IAA/HRP實驗組。第27天處死裸鼠后，稱重瘤體并計算抑瘤率，解剖裸鼠內(nèi)臟，采用HE染色，觀察藥物對各個臟器是否存在毒副作用;通過蛋白免疫印跡檢測各組腫瘤組織中Survivin蛋白的表達情況;實時熒光定量檢測MMP-2、MMP-9mRNA表達水平。
　　結(jié)果:
　　IAA/HRP組瘤重顯著低于生理鹽水組，與5Fu組無明顯差異;實驗結(jié)束后5Fu組裸鼠體重與

10、生理鹽水組裸鼠體重相比有顯著性差異，與IAA/HRP組裸鼠體重相比有顯著性差異，生理鹽水組與IAA/HRP組未見明顯差異;HE染色顯示IAA/HRP在短期內(nèi)應(yīng)用不會對裸鼠內(nèi)臟器官產(chǎn)生毒副作用;蛋白免疫印跡法顯示Survivin條帶密度減小，與5-Fu表達相似;實時熒光定量檢測MMP-2、MMP-9在實驗組中的相對表達量明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.IAA/HRP能有效抑制癌細胞生長，將細胞周期阻

11、滯在G0/G1期，抑制細胞進入增殖周期，誘導(dǎo)癌細胞提早凋亡。并推測出抑制作用最強的時間為48h，有效抑制濃度為:60μmol/LIAA和1.2mg/LHRP。
　　2.IAA/HRP使NF-κBp65陽性表達明顯下調(diào)，且與5-FU組沒有顯著差異;同時IAA/HRP可下調(diào)c-Myb蛋白的表達。
　　3.IAA/HRP對腺樣囊性癌荷瘤裸鼠有抑瘤作用，能夠抑制腫瘤生長;IAA/HRP短期內(nèi)對腺樣囊性癌荷瘤裸鼠的體重及內(nèi)臟無明顯影響