白紋伊蚊唾液腺CTL1基因的表達與功能研究.pdf

1、目的：C型凝集素(C-type lectins，CTLs)是一類鈣依賴型糖結(jié)合蛋白超家族，它在先天免疫中作為模式識別受體發(fā)揮作用，也參與分子的相互作用。在長期的吸血進化過程中，蚊蟲在唾液腺中形成了一系列有助于吸血生存的活性物質(zhì)，這些物質(zhì)能對脊椎動物具有抗凝血、抗炎和調(diào)節(jié)宿主免疫功能的作用，在促進蚊蟲吸血與傳病上具有重要意義。為了更深入的了解C型凝集素在白紋伊蚊唾液腺中的功能，我們對其克隆并原核表達重組蛋白，探討其在在昆蟲先天性免疫中的作

2、用和蚊吸血過程中發(fā)揮的作用。
　　方法：用實時熒光定量RT-PCR構建不同組織表達譜?？寺alb_CTL1基因全長序列并進行生物信息學分析。進一步利用基因工程手段，將Aalb_CTL1插入到表達載體pET28a(+)中，構建Aalb_CTL1基因重組原核表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)純化后用以免疫SD大鼠制備免疫血清。用Western Blotting方法初步分析純化的重組蛋白的免疫學特性。用純

3、化后的重組蛋白進行了紅細胞凝集活性，糖結(jié)合抑制凝集活性，抑菌活性及淋巴細胞增殖作用的功能初步探索。
　　結(jié)果：1.通過構建不同組織的表達譜發(fā)現(xiàn)，Aalb_CTL1特異的高表達于雌蚊唾液腺中。2.成功克隆得到Aalb_CTL1基因，全長462bp，編碼153個氨基酸。Aalb_CTL1基因含有一個19個氨基酸的信號肽，InterPro Scan分析表明其含有一個CRD結(jié)構域。PCR、雙酶切及測序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒 pET28a(+)

4、-Aalb_CTL1構建成功。經(jīng)SDS-PAGE進行檢測分析，發(fā)現(xiàn) Aalb_CTL1基因的表達產(chǎn)物出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，其融合表達產(chǎn)物的大小與預測的一致，利用分步透析進行了蛋白的復性，進一步用Ni-NTA親和層析柱將重組蛋白純化，獲得了高含量高純度的目的蛋白。重組蛋白可被其免疫的SD大鼠血清識別，說明成功獲得Aalb_CTL1多克隆抗體。3.通過細胞凝集活力測定證實Aalb_CTL1具有凝集素最基本的功能——紅細胞凝集活性，而這種凝

5、集活性必須依賴鈣離子的存在；Aalb_CTL1重組蛋白對兔、小鼠及大鼠等脊椎動物紅細胞均有凝集活性。而這種凝集活性可被 D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、蔗糖和麥芽糖所抑制；對甘露糖的結(jié)合能力大于其他糖類的結(jié)合能力。4.通過微量液體稀釋法測重組Aalb_CTL1的半數(shù)抑制濃度（IC50），發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，IC50為22.5μg/ml。5.本研究用 ConA作為刺激劑，觀察了 Aalb_CTL1對離體小鼠脾細胞