綿羊Zfy基因干擾載體篩選及性控效果的驗證.pdf

1、Zfy(Zinc-finger Y)基因位于Y染色體的短臂上,是一段可編碼鋅指蛋白的高度保守基因序列。Zfy基因具有特定的核定位信號區(qū)域,能夠特異性的引導(dǎo)靶基因穿過核膜,定位于精子細(xì)胞核內(nèi),可能對精子變態(tài)過程中的某些基因具有轉(zhuǎn)錄激活作用,與Y精子的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮有關(guān)。本研究根據(jù)Zfy基因特點(diǎn),通過設(shè)計shRNA片段,對綿羊的Zfy基因進(jìn)行細(xì)胞水平上的RNAi實驗,通過qRT-PCR分析后,選取對Zfy基因mRNA表達(dá)水平抑制率最高的片段

2、,通過睪丸注射法注射給雄性公羊,人工授精后,統(tǒng)計經(jīng)干擾后后代的性別比例。具體研究結(jié)果如下:
　　1.綿羊Zfy基因cDNA序列克隆:以人和牛的Zfy基因序列為參考,分段設(shè)計3對引物,采用普通PCR技術(shù)擴(kuò)增,測序,使用DNAMAN軟件拼接及分析,首次克隆到長為2247bp的綿羊Zfy基因mRNA的拼接序列。
　　2.根據(jù)克隆到的綿羊Zfy基因mRNA序列,按照RNAi設(shè)計原則,針對該基因的編碼區(qū)設(shè)計并合成5對shRNA干擾片段

3、。以pll3.7慢病毒骨架質(zhì)粒作為載體,構(gòu)建了5個靶向Zfy基因的shRNA表達(dá)載體(A-E)。經(jīng)過測序證實所構(gòu)建的5個表達(dá)載體含有合成的干擾序列,且調(diào)控元件均完整,插入序列的位置均正確。說明這5個shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功,可以用于綿羊Zfy基因的干擾試驗。
　　3.將構(gòu)建好的5個Zfy基因shRNA重組質(zhì)粒表達(dá)載體進(jìn)行綿羊體外RNAi的研究。屠宰場無菌采回1歲齡綿羊睪丸,采用兩步酶消化法分離生精細(xì)胞和支持細(xì)胞,并進(jìn)行體外培養(yǎng)。

4、通過轉(zhuǎn)染試劑盒(HET)將構(gòu)建好的5個Zfy基因shRNA重組質(zhì)粒表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24h后的生精細(xì)胞。待36-48小時后轉(zhuǎn)染率達(dá)到實驗要求,提取細(xì)胞總RNA,利用熒光實時定量PCR法檢測mRNA的表達(dá)水平。初步在細(xì)胞水平上篩選出1個干擾效果最好的shRNA重組質(zhì)粒表達(dá)載體A,其使Zfy基因表達(dá)水平下降了54％,與對照組相比差異顯著(P<0.05)。
　　4.將篩選的Zfy基因shRNA重組表達(dá)載體進(jìn)行綿羊體內(nèi)RNAi試驗。選取

5、2只健康雄性薩福克羊,分別注射重組質(zhì)粒表達(dá)載體,間隔7天注射一次,連續(xù)注射2次。最后一次注射7天后,采集精液進(jìn)行人工授精,結(jié)果顯示子代綿羊母羔率為54.44%,與正常性別比例差異不顯著;試驗羊群的受胎率為31.2%,與試驗羊場正常受胎率85%相比有明顯下降。檢測重組質(zhì)粒表達(dá)載體A干擾細(xì)胞中Zfx基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量降低了44%,與對照組相比差異顯著(P<0.05),表明表達(dá)載體A在對Zfy基因產(chǎn)生干擾作用的同時也干擾了Zfx基因