犬Zfx-Zfy基因干擾載體構(gòu)建及性控效果的觀察.pdf

1、動物性別控制技術(shù)的相關(guān)研究早在多年前就已經(jīng)開始。目前國際上家畜性別控制技術(shù)方法主要有三種:（1）X精子與Y精子的分離方法。（2）胚胎的性別鑒定方法。（3）控制家畜受精環(huán)境方法。盡管家畜性別控制的方法很多，但由于影響因素較多很難找到合適的即經(jīng)濟又方便的性別控制方法，在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。如今，隨著科學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展，以及對細胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等理論的深入研究，從基因水平研究控制性別已經(jīng)成為一種新的研究方向，同時也使性別控制在生產(chǎn)中應(yīng)用推廣成

2、為了一種可能。
　　性別控制技術(shù)中的性控精液已經(jīng)廣泛應(yīng)用于奶牛、豬等家畜的生產(chǎn)，而RNA干擾技術(shù)在新型的養(yǎng)犬業(yè)中還無人研究。RNA干擾是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象且已被證實和廣泛應(yīng)用。通過體外人工合成或體內(nèi)產(chǎn)dsRNA在細胞內(nèi)特異性地降解其同源的mRNA，使得相應(yīng)的基因沉默，實現(xiàn)阻止目標(biāo)基因表達的目的。Zfx/Zfy基因均屬于ZFY(zinc finger-Y)基因家族，Zfx編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，在精子形成過程中具有一些功能并與

3、精子的發(fā)生有關(guān)。
　　本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建出犬的Zfx、Zfy基因干擾的載體同時進行犬生精細胞、支持細胞體外培養(yǎng)，將干擾載體轉(zhuǎn)入犬生精細胞，利用實時定量PCR檢測Zfx、Zfy基因的表達情況，體外驗證RNA干擾載體的沉默效應(yīng)，篩選出犬體外有效的Zfx、Zfy基因的RNA干擾載體，再利用犬體外Zfy基因沉默效應(yīng)有效的RNA干擾載體對犬進行Zfx、Zfy基因體內(nèi)干擾試驗，最后統(tǒng)計其后代性別比例，以此達到研究人為控制犬性別的

4、目的。具體研究結(jié)果如下：
　　1.犬Zfx\Zfy基因mRNA序列（No. XM_005641207\No. JX964866），按照RNAi設(shè)計原則，針對該基因的編碼區(qū)各設(shè)計并合成3對shRNA干擾片段。以pLL3.7慢病毒骨架質(zhì)粒作為載體，成功地構(gòu)建了6個重組表達載體pLL3.7 xa-xc\pLL3.7ya-yc，經(jīng)測序驗證，成功構(gòu)建了表達載體。
　　2.將構(gòu)建好的6個犬Zfx\Zfy基因shRNA重組質(zhì)粒表達載體進行

5、體外RNAi試驗。初步篩選出細胞水平上對Zfx基因干擾效果較好的表達質(zhì)粒載體pLL3.7-xa，其使Zfx基因表達水平下降了98.7％，與對照組相比差異極顯著（P<0.01）。體外干擾試驗表明， Zfy基因shRNA重組質(zhì)粒pLL3.7ya-yc對Zfy基因表達無干擾效果。
　　3.將篩選出的Zfx基因shRNA重組表達載體進行犬體內(nèi)RNAi試驗。雄犬睪丸注射重組質(zhì)粒表達載體pLL3.7-xa，間隔10d注射一次，連續(xù)注射3次。對

6、公犬進行最后一次注射4d后與飼養(yǎng)的母犬交配。
　　1）第一次動物體內(nèi)干擾實驗，采取同期發(fā)情與人工授精方案，結(jié)果如下：實驗組受胎率為25%（2/8），共產(chǎn)子6只，雌性比例為83.33%（5/6）；對照組受胎率為62.5%（5/8），共產(chǎn)子23只，雌性比例為56.52%(13/23)。實驗組后代雌性性別比例與對照組差異極顯著（P<0.01）。實驗結(jié)果后代性別比例出現(xiàn)了反向偏移，雌性比例明顯升高。為了確定結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們再一次進行了動