馬鈴薯StSUT2基因干擾載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界公認(rèn)的主要糧食作物之一，它的塊莖不僅可以當(dāng)作糧食作物，而且還可以用于工業(yè)生產(chǎn)淀粉等。在植物光合作用產(chǎn)生的碳水化合物，通過韌皮部篩管向儲(chǔ)存庫器官運(yùn)輸并積累的過程中，起到主要作用的就是蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sucrose transporter）。雙子葉植物中的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括SUT1、SUT2和SUT4三類，主要功能就是對(duì)植物光合產(chǎn)物蔗糖的裝載、運(yùn)輸和卸載過程的調(diào)節(jié)作用。在馬鈴薯中，StSU

2、T1蛋白主要對(duì)蔗糖的裝載進(jìn)行調(diào)控，StSUT4蛋白主要對(duì)蔗糖的卸載過程進(jìn)行調(diào)控，并且還與光周期相互作用來調(diào)節(jié)馬鈴薯植株的開花、莖長短和塊莖形成，但是StSUT2蛋白的功能仍是未知的。根據(jù)國內(nèi)外多年來對(duì)高等植物SUT2的研究分析來看，它的結(jié)構(gòu)與葡萄糖信號(hào)感受器類似，因此推測SUT2有可能是蔗糖信號(hào)感受器而不是蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。
　　本研究主要通過構(gòu)建馬鈴薯StSUT2基因的干擾載體，并對(duì)其轉(zhuǎn)化至馬鈴薯中，為對(duì)StSUT2蛋白進(jìn)行功能分析奠

3、定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)主要分為兩部分：一是干擾載體的構(gòu)建，用Gateway克隆技術(shù)可將StSUT2基因干擾片段快速重組到表達(dá)載體中，通過對(duì)重組子進(jìn)行測序，確定為干擾表達(dá)載體；二是馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化，將構(gòu)建好的干擾載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化至馬鈴薯塊莖中，使其再分化產(chǎn)生含有干擾基因的轉(zhuǎn)基因植株。取得的主要成果如下：
　?。?）利用TOPO克隆，將擴(kuò)增出的干擾片段整合到pENTR中，構(gòu)建出入門載體命名為pENTR-SUT2。
　　（2）根據(jù)G

4、ateway克隆技術(shù)進(jìn)行LR重組，根據(jù)入門載體與表達(dá)載體的attL和attR位點(diǎn)重組，構(gòu)建出干擾表達(dá)載體pSUT2-RNAi。
　?。?）用凍融法將干擾載體pSUT2-RNAi轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101中。
　　（4）將干擾載體轉(zhuǎn)化至夏波蒂（SHB）和隴薯3號(hào)（L3）等馬鈴薯品種的塊莖中，通過卡那霉素篩選和PCR擴(kuò)增檢測，初步確定干擾基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入馬鈴薯植株中。用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量檢測表明，干擾基因已經(jīng)