多基因植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建以及對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、蟲害和土壤鹽漬化一直是阻礙農(nóng)林作物生產(chǎn)的兩大重要因素，植物基因工程技術(shù)的發(fā)展為有效解決這兩個問題提供了一條途徑。為了得到高效抗蟲以及既抗蟲又耐鹽的植物轉(zhuǎn)化載體，以大腸桿菌DH10B、農(nóng)桿菌EHA105和煙草為主要試驗材料，通過調(diào)換Bt基因轉(zhuǎn)錄表達框順序，改變啟動子方向，加入中間隔斷，改變選擇標(biāo)記基因的方向和添加耐鹽基因等方法，構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)的植物轉(zhuǎn)化載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對煙草進行遺傳轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)化植株進行PCR鑒定，通過熒光定量PCR進行

2、mRNA轉(zhuǎn)錄豐度的研究，通過酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法和飼蟲試驗對兩種Bt毒蛋白的表達量及抗蟲性進行鑒定，利用鹽脅迫對轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性進行檢測。得到以下研究結(jié)果:
　　1、共構(gòu)建了10個不同結(jié)構(gòu)的植物轉(zhuǎn)化載體，其中N14，N15，N17，N20，N22均含Cry1Ac和Cry3A兩個抗蟲基因，B2含Cry1Ac和gus兩個外源基因;載體N23，N24，N25，N26是在已有的具雙價抗蟲基因（Cry1Ac和Cry3A）載體N5的基礎(chǔ)上，

3、分別添加mtlD，BADH，mtlD+BADH，mtlD+BADH+SacB耐鹽基因而得。將上述11個載體對煙草進行遺傳轉(zhuǎn)化，并進行PCR檢測，共得到轉(zhuǎn)基因株系76個。
　　2、Bt基因的排列順序不同的兩個載體，N15（Cry1Ac基因處于下游）的Cry1Ac毒蛋白平均表達量為6.69μg·g-1，是Cry3A毒蛋白表達量(1.26μg·g-1)的5.3倍;N17（Cry3A基因位于下游）的Cry3A毒蛋白平均表達量為0.82μg

4、·g-1顯著低于Cry1 Ac毒蛋白表達量（4.05μg·g-1）。N15和N17的Cry1Ac和Cry3A基因轉(zhuǎn)錄豐度均未達到顯著差異。結(jié)果表明，Bt基因的排列順序?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄沒有產(chǎn)生影響，對兩個Bt基因毒蛋白表達的高低也沒有影響。
　　3、Cry3A基因啟動子方向不同的兩個載體，N20的Cry3A毒蛋白平均表達量為2.67μg·g-1，比N5（1.81μg·g-1）的高1.5倍;載體N5的Cry1 Ac毒蛋白平均表達量為12.48

5、μg·g-1，比N20（7.31μg·g-1）的高1.7倍。從基因的轉(zhuǎn)錄水平來看，N20的Cry3A基因平均轉(zhuǎn)錄豐度(7.36×107)比N5(4.31×107)的高1.7倍。結(jié)果表明，改變Cry3A基因啟動子的方向，提高了Cry3A基因的表達量和穩(wěn)定性，但在一定程度上降低了Cry1Ac基因的表達量。
　　4、載體N14的Cry3A基因兩端加入中間隔斷，Cry1Ac和Cry3A毒蛋白平均表達量均低于無隔斷的N5的毒蛋白表達量，其中

6、N5的Cry3A毒蛋白平均表達量(1.81μg·g-1)比N14（0.30μg·g-1）的高6倍;載體N22比N20多144一個中間隔斷，Cry1Ac毒蛋白平均表達量(4.19μg·g-1)顯著低于N20(7.31μg·g-1)，Cry3A毒蛋白平均表達量沒有顯著差異。N14與N5的兩個Bt基因平均轉(zhuǎn)錄豐度大小相反;N20與N22的Cry1Ac基因平均轉(zhuǎn)錄豐度未達到顯著差異;Cry3A基因平均轉(zhuǎn)錄豐度(7.36×107)顯著高于N22(

7、3.28×107)。結(jié)果表明，加入中間隔斷一定程度上降低了兩個Bt基因的毒蛋白表達量，但對其轉(zhuǎn)錄不存在特定規(guī)律。
　　5、載體B2選擇標(biāo)記基因nptⅡ的方向與其它6個載體相反，Cry1Ac毒蛋白平均表達量(0.26μg·g-1)顯著低于其它載體。B2的Cry1Ac基因平均轉(zhuǎn)錄豐度(3.83×105)也顯著低于其它載體。結(jié)果表明，改變nptⅡ基因的方向，可能嚴(yán)重抑制了Cry1Ac基因的表達，甚至導(dǎo)致其不表達。
　　6、飼蟲試驗

8、結(jié)果表明，各轉(zhuǎn)基因煙草株系均能對鱗翅目害蟲棉鈴蟲幼蟲和鞘翅目茄二十八星瓢蟲產(chǎn)生抗性;各轉(zhuǎn)基因載體的殺蟲效果大致與毒蛋白表達量的高低相符。
　　7、鹽分脅迫處理36 d時，對4個攜帶耐鹽基因載體的轉(zhuǎn)化植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g株高、葉綠素含量、相對電導(dǎo)率、光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響程度等均不存在顯著性差異，表明轉(zhuǎn)入mtlD，BADH, mtlD+BADH，mtlD+BADH+ SacB耐鹽基因并未顯著提高煙草的耐鹽性。
　　8