綿羊MBL基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及抗病相關(guān)miRNA的篩選.pdf

1、綿羊支原體肺炎（Mycoplasma pneumonia,MP）是以咳嗽、喘氣，漸進(jìn)性消瘦及慢性增生性間質(zhì)性肺炎為特征的綿羊慢性呼吸道傳染病，致病機(jī)制比較復(fù)雜，臨床診斷和防治比較困難。甘露糖結(jié)合凝集素(Mannan-binding lectin，MBL)作為天然免疫系統(tǒng)的一員，直接介導(dǎo)或通過凝集素途徑激活補(bǔ)體，在機(jī)體天然免疫防御、免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用。
　　目的：分析MBL蛋白在肺炎支原體感染引起的天然免疫中發(fā)揮的作用以及MBL

2、蛋白在個(gè)體感染中的治療效果，驗(yàn)證MBL蛋白與綿羊支原體肺炎的抗性關(guān)系。
　　方法：（1）采集健康綿羊的肝臟，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增MBL編碼區(qū)序列。經(jīng)EcoRI和Hind III雙酶切后，MBL目的基因和真核表達(dá)載體pTT5連接，構(gòu)建綿羊MBL基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒pTT5-MBL，轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO細(xì)胞和293細(xì)胞表達(dá)并分離純化重組MBL蛋白。依據(jù)血清MBL分離純化方法分離純化綿羊血漿來源MBL蛋白。通過氣管注射方

3、法人工感染綿羊肺炎支原體，人工感染后每日觀察其臨床癥狀，人工感染14d時(shí)分別靜脈注射重組MBL蛋白和血漿來源MBL蛋白，觀察其臨床癥狀，蛋白注射四周后宰殺。（2）在蛋白治療-1d、7d、14d、21d、28d采集新鮮血液和血清，用ELISA方法和熒光定量PCR分析血清中MBL、TNF-α、IFN-γ、補(bǔ)體C1、C3、IL-2、IL-4的濃度變化和表達(dá)水平。（3）蛋白注射四周后對抗病組和易感組患病綿羊屠宰取樣，采集肝臟組織，放入液氮儲(chǔ)存，

4、送生物公司進(jìn)行miRNA HiSeq高通量測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選差異miRNA。
　　結(jié)果：
　?。?）成功構(gòu)建了綿羊MBL基因真核表達(dá)載體pTT5-MBL，表達(dá)并純化出有活性的重組MBL。成功分離純化出有活性的血漿來源MBL蛋白。人工感染組綿羊在感染后均出現(xiàn)了咳嗽、食欲減退、流鼻涕、腹瀉等支原體癥狀。綿羊肺炎支原體回收培養(yǎng)，多項(xiàng)支原體生化鑒定和支原體PCR鑒定結(jié)果表明人工感染組綿羊均成功感染了綿羊肺炎支

5、原體，證明人工感染成功。MBL蛋白注射后，注射蛋白后均出現(xiàn)了不同程度的體溫下降，食欲恢復(fù)，與實(shí)驗(yàn)對照組相比，注射蛋白的兩組剖檢的眼觀變化和切片的病理變化可見癥狀有輕微的減輕。（2）蛋白注射后，血清中的IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C3均在短期內(nèi)有不同程度的升高，在蛋白注射14d后又逐漸降低，并且在不同時(shí)期均高于實(shí)驗(yàn)對照組。血清中C1表現(xiàn)為先降后升。說明注射蛋白后機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能均有所增強(qiáng)。注射MBL蛋白后患病機(jī)

6、體MBL、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C1和C3表達(dá)水平均有不同程度的升高，隨后逐漸降低，說明隨著病程的發(fā)展，炎癥有所舒緩。（3）篩選出多多個(gè)免疫相關(guān)的miRNA和信號通路。
　　結(jié)論：（1）建立了綿羊MBL基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法。（2）MBL蛋白免疫治療能短期內(nèi)減輕綿羊支原體肺炎的臨床癥狀和病理變化，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，提高機(jī)體的抗病能力，改善炎癥狀況。（3）利用高通量測序技術(shù)篩選出多個(gè)免疫相關(guān)的m