免疫球蛋白結(jié)合分子定點(diǎn)隨機(jī)突變組合噬菌體展示文庫的構(gòu)建.pdf

1、目的：構(gòu)建免疫球蛋白結(jié)合分子定點(diǎn)隨機(jī)突變組合噬菌體展示文庫，為應(yīng)用各種類型免疫球蛋白對該文庫進(jìn)行體外分子進(jìn)化篩選及研究免疫球蛋白結(jié)合分子結(jié)構(gòu)和功能打下基礎(chǔ)。 方法：應(yīng)用overlapping PCR制備Protein A的Z結(jié)構(gòu)域。再用含隨機(jī)核苷酸序列的引物，制備對Z結(jié)構(gòu)域的第10、13、27、28、31和32位氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變的定點(diǎn)隨機(jī)突變體，并在突變體片段兩端引入 Kpn Ⅰ位點(diǎn)，3′端引入3個(gè)氨基酸大小隨機(jī)連接肽的序列進(jìn)

2、行隨機(jī)連接。突變體片段經(jīng)KpnⅠ酶切后，克隆于噬菌粒展示載體pCANTAB5S。克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，輔助噬菌體M13K07拯救，構(gòu)建噬菌體展示定點(diǎn)隨機(jī)突變組合文庫。 結(jié)果：該定點(diǎn)隨機(jī)突變組合文庫的庫容為2.7×10<'7>個(gè)，滴度為1.4×10<'12>TU·mL<'-1>；文庫中含0.72以上的陽性克隆，其中有2個(gè)單結(jié)構(gòu)域的陽性克隆占0.15；15個(gè)樣品的序列分析顯示各突變位點(diǎn)和隨機(jī)連接肽的氨基酸序列呈隨機(jī)性分布。