香橙CjMATE基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、多藥與有毒化合物外排基因(MATE)是一類新型的二級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族,在擬南芥中有56個(gè)家族成員,這類基因編碼的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鋁和植物耐缺鐵的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。香橙是一種極耐缺鐵的植物,而且能在酸性土壤中正常生長(zhǎng)。鑒于香橙的特性,克隆并分析其MATE基因的功能,不僅可以進(jìn)一步了解香橙耐缺鐵的分子機(jī)理,還可以利用基因工程技術(shù)將香橙MATE基因用于植物耐酸性土壤和耐缺鐵的作物育種上,從而有助于提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。
　　

2、 本文以擬南芥中耐缺鐵基因AtFRD3的保守序列設(shè)計(jì)引物,以缺鐵誘導(dǎo)的香橙根的cDNA文庫(kù)為模板擴(kuò)增得到一段序列,然后通過(guò)RACE技術(shù)延伸得到長(zhǎng)度為1.8kb的cDNA序列。序列分析顯示該序列的ORF長(zhǎng)度為1551bp,編碼516個(gè)氨基酸殘基且有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該序列編碼的氨基酸與其他MATE基因具有高度同源性。與高粱耐鋁基因SbMATE相同性為60%,與擬南芥鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因AtFRD3相同性為59%,而與擬南芥耐鋁基

3、因AtMATE相同性為70%,因此將該基因命名為CjMATE。Real-Time PCR分析發(fā)現(xiàn)CjMATE基因在香橙的根、莖、葉中都有表達(dá),且在根中表達(dá)量最高,該基因的表達(dá)不受缺鐵誘導(dǎo),但受鋁誘導(dǎo)。為研究CjMATE基因功能和表達(dá)模式,構(gòu)建CjMATE基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化缺鐵及鋁敏感型擬南芥突變體和苜蓿中,確定CjMATE基因是否具有耐鋁或耐缺鐵功能。
　　 本文研究了轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鋁和耐缺鐵特性,測(cè)定了轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片的有機(jī)酸

4、含量、鋁元素含量,進(jìn)行了耐鋁實(shí)驗(yàn)分析。得到以下結(jié)果:
　　 1.用CjMATE基因轉(zhuǎn)化擬南芥突變體(frd3-1、frd3-3、AtALMT1-KO、AtMATE-KD、Double KO/KD),獲得轉(zhuǎn)基因植株共85株。缺鐵敏感型突變體frd3-3在20μmol/L的Fe2+條件下生長(zhǎng)出現(xiàn)缺鐵黃化現(xiàn)象,而突變體frd3-3的轉(zhuǎn)基因植株在相同條件下生長(zhǎng)并未出現(xiàn)黃化現(xiàn)象,與野生型生長(zhǎng)狀況相一致。轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)檸檬酸含量與frd3-

5、3相比升高約34.2%,而鐵含量降低30.5%。說(shuō)明CjMATE基因在植物鐵從根到莖的運(yùn)輸中起作用。
　　 2.與野生型擬南芥相比,鋁敏感型突變體AtALMT1-KO、AtMATE-KD、DoubleKO/KD在1.5μmol/L的Al3+條件下,根的伸長(zhǎng)會(huì)受到嚴(yán)重抑制,而其相應(yīng)的CjMATE轉(zhuǎn)基因植株在相同鋁脅迫下,根的相對(duì)伸長(zhǎng)量(%RNRG)大于非轉(zhuǎn)基因植株。其中轉(zhuǎn)基因植株比AtALMT1-KO提高了35%,比AtMATE-

6、KD提高了33%,比Double KO/KD提高了29%,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株根相對(duì)伸長(zhǎng)量提高了13%。由此說(shuō)明CjMATE基因在植物耐鋁過(guò)程也起一定作用。
　　 3.獲得CjMATE轉(zhuǎn)基因苜蓿植株20株,對(duì)CjMATE基因進(jìn)行熒光定量PCR分析后,篩選出4個(gè)超量表達(dá)植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)有機(jī)酸進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因植株葉片草酸含量為:0.46-0.63mg/g(FW),檸檬酸含量為:0.56-078mg/g,蘋(píng)果酸含量

7、為0.66-0.97mg/g,野生型葉片中三種有機(jī)酸含量分別是0.41、0.48、0.56mg/g。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株葉片中三種有機(jī)酸含量分別提高12.0%～53.8%、16.3%～61.6%、18.8%～72.5%。
　　 4.對(duì)CjMATE轉(zhuǎn)基因苜蓿進(jìn)行耐鋁試驗(yàn),結(jié)果表明:與野生型相比,在受到50μmol/LAl3+脅迫后,轉(zhuǎn)基因苜蓿根尖苯胺藍(lán)染色減弱。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因苜蓿受到的鋁毒害減少。
　　 5.與野生型苜蓿相