水茄(Solanum torvum)StUBCc基因的克隆及功能初步分析.pdf

1、茄子黃萎病是危害茄子的主要土傳病害之一，它會(huì)引起茄子減產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。栽培種茄子材料中沒(méi)有有效的抗黃萎病茄子資源，高抗材料均為野生種。茄子近緣野生種水茄(Solanumtorvum)具有較強(qiáng)的抗黃萎病能力，幾乎接近免疫的程度，從水茄中克隆與黃萎病抗性相關(guān)的基因，對(duì)改善茄子抗病性具有重要價(jià)值。本研究以課題組前期構(gòu)建的黃萎病菌侵染下水茄的抑制差減文庫(kù)(SSH)為基礎(chǔ)，對(duì)其中的159條差異序列重新進(jìn)行序列比對(duì)，挑取可能與抗病相關(guān)的序列進(jìn)行

2、差異表達(dá)驗(yàn)證及表達(dá)模式分析。利用RACE技術(shù)克隆可能與抗病相關(guān)的候選ESTs的基因全長(zhǎng)，并利用VIGS方法對(duì)克隆得到的全長(zhǎng)基因進(jìn)行功能初步分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用qRT-PCR方法分析從SSH-cDNA文庫(kù)中挑取的12條可能與抗病相關(guān)的泛素（4條）、激素（4條）和抗病蛋白（4條）的ESTs序列，驗(yàn)證其在黃萎病菌侵染下不同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)性，分析表達(dá)模式。結(jié)果表明，12條ESTs在黃萎病菌侵染下的表達(dá)量與對(duì)照相比不同。

3、在侵染2h內(nèi)，每條EST在黃萎病菌處理的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相差不大;侵染4h后，表達(dá)量都高于對(duì)照，上調(diào)表達(dá)。
　　2.采用RACE技術(shù)克隆獲得了水茄StUBCc基因全長(zhǎng)序列，對(duì)其進(jìn)行功能初步分析。序列分析顯示StUBCc基因全長(zhǎng)756 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?59 bp，編碼152個(gè)氨基酸，具有UBCc基因家族結(jié)構(gòu)域。同源性分析發(fā)現(xiàn)StUBCc基因與葡萄的泛素結(jié)合酶E2-2(UBC2)的同源性最高，達(dá)99％。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示水茄中該基

4、因編碼的蛋白與葡萄聚在同一分支，親緣關(guān)系最近，其次為擬南芥和矮牽牛。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，StUBCc基因表達(dá)量在水茄中受到黃萎病菌侵染明顯增加，在侵染后6h達(dá)到最大值，其表達(dá)量是對(duì)照的6.79倍，推測(cè)該基因可能參與病原菌侵染初期的應(yīng)答過(guò)程。
　　3.利用VIGS方法在水茄中初步分析了StUBCc基因的功能。選取301 bp的基因沉默片段，利用同源重組法（In-Fusion技術(shù)），成功構(gòu)建了StUBCc基因沉默的表達(dá)載體，用