龍眼ELF4同源基因的克隆及功能初步分析.pdf

1、在熱帶亞熱帶地區(qū)，龍眼(Dimocarpus longanL.)是一個(gè)重要的木本果樹。本研究在RNA-Seq的基礎(chǔ)上，首先通過序列分析和比對(duì)，找到龍眼中107個(gè)與調(diào)控開花時(shí)間相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)DlELF4-1和DlELF4-2可能與‘四季蜜’龍眼特殊成花性狀相關(guān)；進(jìn)一步克隆獲得DlELF4-1和DlELF4-2全長cDNA，通過生物信息學(xué)和熒光定量PCR分析對(duì)其功能進(jìn)行初步分析；同時(shí)克隆了‘四季蜜’和‘紅核子’龍眼DlELF4-1基因的啟

2、動(dòng)子序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；還構(gòu)建了DlELF4-1和DlELF4-2植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究DlELF4-1和DlELF4-2功能做準(zhǔn)備。研究結(jié)果有助于了解龍眼開花調(diào)控的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　1.在以‘四季蜜’龍眼和‘立冬本’龍眼的嫁接新梢為材料的RNA-seq數(shù)據(jù)庫中，找到了107個(gè)開花時(shí)間同源基因。這些基因進(jìn)一步的被歸類為生物鐘和光周期途徑，春化途徑，自主途徑，GA途徑，年齡相關(guān)基因和成花途徑整合基因等

3、6類。采用log2(S_RPKM/L_RPKM)方法比較了這107個(gè)基因在‘四季蜜’和‘立冬本’兩個(gè)樣品中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn) ELF4（Unigene4309和Unigene5963）在兩樣本中表達(dá)差異較大，其中ELF4(Unigene4309)在‘四季蜜’中表達(dá)量顯著的上調(diào)。熒光定量 PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了ELF4(Unigene4309)在‘四季蜜’中表達(dá)量的變化，表明在調(diào)控‘四季蜜’龍眼特殊成花性狀上，ELF4(Unigene4309)

4、可能起著重要的作用。
　　2.在 RNA-seq數(shù)據(jù)庫中，找到了兩個(gè) ELF4基因的拼接序（ Unigene4309和Unigene5963），其中Unigene4309包含完整的編碼區(qū)，命名為DlELF4-1；Unigene5963包含ELF4基因的部分編碼區(qū)，命名為DlELF4-2。本試驗(yàn)中以‘紅核子’龍眼葉芽為材料，克隆了兩個(gè)龍眼ELF4同源基因cDNA序列。DlELF4-1cDNA全長為544 bp,編碼140個(gè)氨基酸，等

5、電點(diǎn)為5.05，為酸性不穩(wěn)定蛋白；DlELF4-2 cDNA全長為733 bp,編碼144個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.17，為酸性不穩(wěn)定蛋白。序列分析結(jié)果表明DlELF4-1和DlELF4-2蛋白具有ELF4蛋白的保守作用域DUF1313。聚類分析結(jié)果表明DlELF4-1和AtELF4聚在一起，DlELF4-2和AtELF4-LIKE1聚在一起。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究兩個(gè)DlELF4基因在‘紅核子’龍眼花芽分化過程的表達(dá)。結(jié)果

6、表明，DlELF4-1基因在11月份表達(dá)量急劇下降，表明DlELF4-1功能與抑制花芽分化有關(guān)；DlELF4-2基因在1月份開始下調(diào)表達(dá)，表明它可能抑制花芽形態(tài)的分化。DlELF4-1和DlELF4-2基因在調(diào)控龍眼開花時(shí)間上功能可能有所不同。
　　4.為了探究引起DlELF4-1表達(dá)差異的原因及進(jìn)一步了解DlELF4-1的功能，本試驗(yàn)中以‘四季蜜’龍眼和‘紅核子’龍眼的葉片為材料，克隆DlELF4-1的啟動(dòng)子序列，最終獲得‘四季

7、蜜’龍眼DlELF4-1起始密碼ATG上游序列1330bp，獲得‘紅核子’龍眼DlELF4-1起始密碼ATG上游序列419bp。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)在‘四季蜜’和‘紅核子’龍眼中DlELF4-1基因起始密碼ATG上游-1bp—-249bp之間序列一樣，而‘四季蜜’中的-250bp—-1330bp和‘紅核子’中的-250bp—-419bp序列存在差異。啟動(dòng)子序列分析結(jié)果表明DlELF4-1 的表達(dá)受光、激素及逆境脅迫調(diào)控。與‘紅核子’

8、相比，在‘四季蜜’中有多個(gè)光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件及其他調(diào)控元件，這些差異是否是引起DlELF4-1在‘四季蜜’和‘立冬本’嫁接新梢中差異表達(dá)的原因，需要進(jìn)一步克隆‘紅核子’DlELF4-1基因的啟動(dòng)子序列并進(jìn)行分析。
　　5.為了進(jìn)一步研究DlELF4-1基因和DlELF4-2基因的功能，在本試驗(yàn)中，將DlELF4-1連接到 pBI121質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒 pBI121-DlELF4-1；將 DlELF4-2