薤白EPSPs基因cDNA的克隆及功能的初步研究.pdf

1、原核生物、酵母、真菌、寄生蟲、植物和藻類中的EPSP合成酶(EPSPs)是這些生物芳香族氨基酸合成過程的關(guān)鍵酶。作為莽草酸途徑中的一個(gè)必需酶，EPSPs可逆地催化莽草酸-3-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸縮合成EPSP并產(chǎn)生無機(jī)磷。草甘膦與磷酸烯醇式丙酮酸的結(jié)構(gòu)相似，可以競(jìng)爭(zhēng)地與莽草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，特異性抑制EPSPs活性，是一種廣譜滅生性除草劑。而且草甘膦在土壤中可以被降解為無毒成分，因而被認(rèn)為是一種較為安全的優(yōu)良除草劑。植物中EPSP

2、s的過量表達(dá)或某些活性位點(diǎn)氨基酸的突變可導(dǎo)致其對(duì)高劑量的草甘膦的耐受性。為了提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，從細(xì)菌中分離的耐草甘膦EPSPs基因被克隆并轉(zhuǎn)入多種農(nóng)作物中，培育出抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物并推廣應(yīng)用獲得了很好的效果。 生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)一種百合科蔥屬植物薤白具有較強(qiáng)的草甘膦抗性，其抗性來源極有可能是由于其EPSP合成酶的結(jié)構(gòu)或表達(dá)獨(dú)特性，使其與草甘膦的結(jié)合能力下降而產(chǎn)生的。這種自然發(fā)生的草甘膦抗性并不多見，可為農(nóng)作物抗草甘膦的基因工程提供

3、更安全的植物來源基因資源，很有必要加以深入研究。 根據(jù)同源比較其它高等植物中EPSP合成酶基因，獲得該基因的保守序列區(qū)并設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并寡核甘酸引物。以薤白的總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，克隆出了EPSPs基因0.5 Kb的中心片段，然后通過RACE技術(shù)分別獲得基因3’端包含多聚A尾的序列和5’端序列，最后獲得了薤白EPSPs cDNA全序列。薤白EPSPsA cDNA全長(zhǎng)為1821 bp，可以翻譯成一段包含522個(gè)氨基酸的推

4、測(cè)蛋白質(zhì)。經(jīng)BLAST及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)分析，證實(shí)我們得到的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列，將其命名為EPSPsA，并將此序列提交GenBank，登錄號(hào)為：DQ462442。 為了進(jìn)一步了解EPSPsA基因在薤白組織中的表達(dá)情況，揭示薤白芳香族氨基酸合成及其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以薤白18S rRNA為內(nèi)參基因，EPSPs基因3’非保守區(qū)域?yàn)闄z測(cè)目的基因，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)薤白EPSPs基因的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，建立一個(gè)針

5、對(duì)：EPSPs的特異、穩(wěn)定的RT-PCR半定量檢測(cè)體系。結(jié)果顯示在薤白根、莖、老葉、嫩葉中都可檢測(cè)到EPSPsA基因的表達(dá)，其表達(dá)水平為：嫩葉>根>莖>老葉，相對(duì)表達(dá)量依次為：O.631，0.246，0.218，0.120。 根據(jù)EPSPsA基因序列及原核表達(dá)載體pMAL-p2X載體多克隆位點(diǎn)序列，采用PCR的方法將EPSPsA基因構(gòu)建到pMAL-p2X載體上獲得融合表達(dá)載體pMAL-p2X-EPSPsA，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌TB1中

6、表達(dá)，通過IPTG的誘導(dǎo)和SDS-PAGE的方法初步分析了表達(dá)產(chǎn)物，能誘導(dǎo)產(chǎn)生一條預(yù)計(jì)大小的蛋白誘導(dǎo)帶；將表達(dá)Ef)SPsA的細(xì)菌接種于含草甘膦的培養(yǎng)基中，檢測(cè)到細(xì)菌對(duì)草甘膦的抗性有所提高。利用大腸桿菌pREST-A表達(dá)系統(tǒng)，將除掉部分信號(hào)肽的薤白EPSPsA cDNA克隆表達(dá)，當(dāng)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)后，大腸桿菌對(duì)草甘膦的耐受性比pMAL-p2X-EPSPsA明顯提高。推測(cè)可能是薤白EPSP合酶信號(hào)肽的存在，而不能在大腸桿菌中

7、正確定位。將克隆的薤白EPSPsA cDNA正向插入到植物表達(dá)載體pWMl01中，并置于35S啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成植物過表達(dá)薤白EPSPsA的重組基因。以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將過表達(dá)薤白EPSPsA的重組基因轉(zhuǎn)入煙草“WS38”，先通過潮霉素抗性篩選獲得了轉(zhuǎn)基因的抗性愈傷組織，當(dāng)愈傷組織培養(yǎng)3w后，將愈傷接種于含有草甘膦的培養(yǎng)基中，鑒定其草甘膦抗性。結(jié)果表明，對(duì)照煙草愈傷組織對(duì)草甘膦極為敏感，在50 mg/L濃度時(shí)，2w內(nèi)即全部壞死。而轉(zhuǎn)基因