水稻OsPEN1基因的克隆及功能初步研究.pdf

1、近年來，隨著許多抗性基因(R基因)的克隆，對(duì)植物與病原物相互作用分子機(jī)理的研究取得了許多突破性進(jìn)展，推動(dòng)了對(duì)植物抗性的研究。然而與R基因控制的植物抗性研究相比，對(duì)植物非寄主抗性分子基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)還比較滯后。非寄主抗性是植物對(duì)大多數(shù)病原物產(chǎn)生抗性，對(duì)少數(shù)病原物感病，是最主要的抗病類型，它不是由植物單個(gè)?；钥共』蚩刂频模灰纂S著病原微生物的變異而喪失，具有穩(wěn)定持久抗性的特點(diǎn)，因此在農(nóng)業(yè)上有廣闊的應(yīng)用前景。 大麥白粉病菌(Blumer

2、iagraminisfsp.Hordei，Bgh)對(duì)擬南芥本身是不致病的，通過篩選Bgh對(duì)擬南芥有高致病力的擬南芥突變體克隆了PEN基因，目前有三個(gè)基因AtPEN1(=AtSYP121)，AtPEN2租AtPEN3參與控制形成抗性物質(zhì)的生物合成和分泌過程，AtPEN1編碼一個(gè)可溶N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的因子適配器蛋白質(zhì)受體(SNARE)結(jié)構(gòu)域和質(zhì)膜定位的Syntaxin，參與調(diào)控囊泡的分泌途徑，說明存在與囊泡相關(guān)的抗性機(jī)制產(chǎn)生對(duì)粉

3、狀病原物的非寄主抗性。擬南芥AtPEN1和大麥HvROR2對(duì)植物非寄主抗性的研究起著重要作用，我們通過研究也發(fā)現(xiàn)擬南芥AtPEN1對(duì)小麥白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.trtici，Bgt)的非寄主抗性也同樣起著非常重要作用，水稻OsPEN1與擬南芥AtPEN1和大麥HvROR2的同源性非常高，它們都含有非常保守的Qa-SNARE結(jié)構(gòu)域，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)道水稻OsNPSN11編碼的Qb-SNARE參與稻瘟病抗性，并將該

4、基因申請(qǐng)了專利。Qa-SNARE與Qb-SNARE同屬于SNARE蛋白家族，于是我們推測(cè)OsPEN1對(duì)水稻抗性起著重要作用。 本研究通過在NCBI網(wǎng)站上BLAST比對(duì)，在水稻日本晴中獲得了與擬南芥AtPEN1和大麥HvROR2的同源序列OsPEN1，通過PCR法成功克隆了OsPEN1基因，對(duì)OsPEN1基因構(gòu)建過量表達(dá)和RNA干涉載體并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，通過PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性植株，然后通過RT-PCR及Northem雜

5、交分析轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株接種水稻真菌稻瘟病菌和紋枯病菌和水稻細(xì)菌白葉枯病菌進(jìn)行抗病性鑒定，最后對(duì)OsPEN1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其主要的研究結(jié)果如下： 1.0sPEN1基因的克隆。由于OsPEN1基因無內(nèi)含子，以水稻日本晴植株總DNA為模板，設(shè)計(jì)OsPEN1基因的特異引物，PCR法克隆了OsPEN1基因，瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，并連接進(jìn)pMD18-T載體中，酶切、測(cè)序鑒定重組陽性質(zhì)粒。 2.植物表達(dá)載體的構(gòu)建

6、。將重組質(zhì)粒和植物的表達(dá)載體分別用相應(yīng)的限制酶酶切后，將酶切的OsPEN1片段亞克隆到表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)載體，用酶切、PCR鑒定和測(cè)序的方法鑒定出重組陽性質(zhì)粒pCAMBIA-OsPEN1和pUC-OsPEN1，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻日本晴。 3.T0轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)。獲得卡那霉素抗性植株22株RNA干涉和22株過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株，經(jīng)PCR檢測(cè)，從22株過量表達(dá)水稻植株中獲得了20株轉(zhuǎn)基因陽性苗，從22株RNA

7、干涉水稻植株中獲得了17株轉(zhuǎn)基因陽性苗。 4.0sPEN1基因的RT-PCR分析。取轉(zhuǎn)基因植株葉片提取RNA，對(duì)OsPEN1進(jìn)行RT-PCR，發(fā)現(xiàn)OsPEN1的過表達(dá)水稻植株的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照植株，RNA干涉水稻植株低于對(duì)照植株，表明在轉(zhuǎn)錄水平上，OsPEN1在轉(zhuǎn)基因水稻植株中得到了正常表達(dá)。分別取接種紋枯病菌前和接種紋枯病菌后的轉(zhuǎn)基因植株葉片，提取RNA，對(duì)PR-1，NPR-1基因進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株接種紋

8、枯病菌后其表達(dá)水平比接種前高，說明OsPEN1的表達(dá)受到紋枯病菌的誘導(dǎo)。 5.轉(zhuǎn)基因植株的Northernblotting分析。對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行Northernblotting分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，12株過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性苗比對(duì)照表達(dá)量高，10株RNA干涉水稻轉(zhuǎn)基因陽性苗比對(duì)照表達(dá)量低，表明OsPEN1在轉(zhuǎn)基因植株中得到了正常的表達(dá)。 6.轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定。分別對(duì)轉(zhuǎn)基因RNA干涉和過量表達(dá)水稻植株接種水稻稻

9、瘟病菌，水稻白葉枯病菌和水稻紋枯病菌進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)水稻植株比轉(zhuǎn)基因RNA干涉水稻植株表現(xiàn)為抗病，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旮胁顟B(tài)介于兩者之間，OsPEN1基因表現(xiàn)出對(duì)多種病菌抗病，可能與植物的非寄主抗性有關(guān)。 7.生物信息學(xué)分析。OsPEN1蛋白含一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)域?yàn)?84-305區(qū)域。OsPEN1蛋白的212-274位點(diǎn)為Qa-SNARE核心結(jié)構(gòu)域，核心結(jié)構(gòu)域比較保守，OsPEN1蛋白的Qa-SN