水稻OsTLP基因的克隆及其功能研究.pdf

1、葉綠體是植物細(xì)胞內(nèi)一個(gè)特殊且重要的細(xì)胞器，是進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，還是脂肪酸和色素合成、無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨基酸的重要場(chǎng)所，是目前質(zhì)體中研究的最詳細(xì)、功能最重要的一種細(xì)胞器。植物葉綠體內(nèi)部由基質(zhì)和類囊體組成，基質(zhì)是光合作用暗反應(yīng)的場(chǎng)所，類囊體是植物進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵部位，光反應(yīng)及大部分與光合作用有關(guān)的蛋白質(zhì)和蛋白復(fù)合物均定位于類囊體膜及類囊體腔中。因此了解類囊體膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能對(duì)于全面了解植物光合作用的分子機(jī)理有重大意義。
　　我們利

2、用生物信息學(xué)方法，在水稻中分析預(yù)測(cè)到一個(gè)定位于葉綠體類囊體基因—OsTLP基因；并使用RT-PCR技術(shù)克隆到OsTLP基因的全長(zhǎng)cDNA，序列分析其含有一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼的蛋白質(zhì)含有257個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與玉米、擬南芥等其他高等植物的氨基酸序列同源性高達(dá)50％以上。利用在線軟件TargetP1.1等預(yù)測(cè)得知該蛋白質(zhì)定位于葉綠體中。通過半定量PCR方法分析了OSTLP基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，OsTLP基因在葉中

3、表達(dá)量最高，而在根中幾乎不表達(dá)，且其表達(dá)具有節(jié)律性。
　　利用表達(dá)載體pCAMBIA1301，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-OsTLP及干擾載體pCAMBIA1301-OsTLPRi，轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105中，分別轉(zhuǎn)化煙草和水稻。經(jīng)篩選得到轉(zhuǎn)基因苗，再經(jīng)PCR鑒定及GUS染色檢測(cè)初步證實(shí)獲得轉(zhuǎn)基因植株。和對(duì)轉(zhuǎn)OsTLP基因的幼苗進(jìn)行透射電鏡（TEM）觀察，結(jié)果表明：與對(duì)照組（轉(zhuǎn)化空載體pCAMBIA1301）相比，超表

4、達(dá)OsTLP基因的植株葉綠體超微結(jié)構(gòu)較對(duì)照組葉綠體的形態(tài)有顯著的變化，超表達(dá)植株葉綠體類囊體膜上的片層數(shù)目明顯增加且更為緊密。
　　根據(jù)水稻OsTLP基因上游序列擴(kuò)增啟動(dòng)子，通過Plantcare對(duì)OsTLP基因啟動(dòng)子順式調(diào)控元件進(jìn)行分析表明：序列中除包含基本的啟動(dòng)元件及大量的CAAT盒（與增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率有關(guān)）外，還包含大量光調(diào)節(jié)相關(guān)元件，如3-AF1bindingsite、GATA-box和I-box，此外還含有ABRE序列（與脫