水稻類囊體腔蛋白OsTLP27及顯性O(shè)sDET1基因的功能分析研究.pdf

1、葉綠體是藻類和高等植物光合反應(yīng)的場所,是由包圍可溶基質(zhì)的被膜和高度特化的類囊體膜組成。由類囊體膜包圍的是一個(gè)狹窄連續(xù)的整體空間,叫做類囊體腔。自從菠菜的類囊體腔蛋白質(zhì)組被首次分離鑒定后,人們對這個(gè)亞細(xì)胞器在光合作用的調(diào)節(jié)和保護(hù)功能的研究越來越多。蛋白質(zhì)組學(xué)研究預(yù)測擬南芥類囊體腔含有80-200個(gè)蛋白。這些蛋白分別具有光合電子傳遞、放氧、蛋白折疊、蛋白酶等生物學(xué)功能,表明類囊體腔在光合結(jié)構(gòu)的進(jìn)化、優(yōu)化、累積和修復(fù)等過程中,可以保證其自身在

2、多變和脅迫環(huán)境下正常運(yùn)轉(zhuǎn)。后又發(fā)現(xiàn)在類囊體腔具有核酸代謝和氧化還原調(diào)節(jié)方面的證據(jù),就更加豐富了類囊體腔的功能,人們對這個(gè)亞細(xì)胞器功能的認(rèn)識也越來越深刻。但到目前為止,在水稻中對類囊體腔相關(guān)蛋白功能研究的報(bào)道只有兩個(gè):在擬南芥和煙草中異源表達(dá)OsCYP20-2和FKBP16-3可提高植株對非生物環(huán)境脅迫的能力。因此,研究水稻類囊體腔蛋白的功能對豐富水稻基因功能研究將會具有重要意義,同時(shí)也有可能會發(fā)現(xiàn)一些對水稻育種方面有價(jià)值的基因。

3、　　在本研究中,我們鑒定了一個(gè)與擬南芥AtTLP具有53％同源性的水稻類囊體腔蛋白OsTLP27(OryzasativaThylakoidlumenprotein,27kDa),含有257aa,理論分子量為27kDa。通過反向遺傳學(xué)手段和生理生化分析對該蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,主要結(jié)論如下:
　?、貽sTLP27基因編碼一個(gè)擬南芥類囊體腔蛋白同系物(AtTLP),蛋白含有一個(gè)DUF1499結(jié)構(gòu)域;
　　生物信息學(xué)分析表明OsT

4、LP27的同源基因在高等植物中廣泛分布,可見該基因在植物生長發(fā)育中的作用十分重要。聚類分析表明單子葉和雙子葉TLP蛋白在進(jìn)化分析樹中存在兩個(gè)分支。BLAST序列比對發(fā)現(xiàn)OsTLP27與擬南芥類囊體腔蛋白基因AtTLP(At4g24930)具有53%的同源性。OsTLP27基因在親緣關(guān)系上,相比雙子葉植物,與單子葉植物進(jìn)化關(guān)系更近。在植物質(zhì)體數(shù)據(jù)庫(PPDB)中搜索OsTLP27,發(fā)現(xiàn)其蛋白N端含有一個(gè)50aa的葉綠體轉(zhuǎn)移肽和一個(gè)DUF1

5、499結(jié)構(gòu)域,可見OsTLP27的功能有待深入研究。
　?、贠sTLP27主要在葉片和葉鞘等綠色組織中表達(dá),且受節(jié)律控制;
　　利用定量PCR檢測了OsTLP27在日本晴不同組織中的表達(dá),這其中包括苗期葉片,分蘗期葉片和根,抽穗期葉片、葉鞘、根和花器官、成熟期葉片、葉鞘、莖和幼胚,結(jié)果顯示OsTLP27主要在綠色組織中表達(dá),表明其可能參與光合作用。利用半定量RT-PCR檢測了OsTLP27在24h光照/24h黑暗條件下mRN

6、A水平,結(jié)果表明OsTLP27在葉片中的表達(dá)受到節(jié)律控制。
　?、跲sTLP27是一個(gè)類囊體腔外周蛋白。
　　構(gòu)建了35S::OsTLP27-GFP融合表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體,利用激光共聚焦顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位的瞬時(shí)表達(dá)綠色熒光,結(jié)果表明OsTLP27定位于葉綠體中。利用葉綠體subfraction標(biāo)記蛋白抗體和OsTLP27特異抗體研究OsTLP27在葉綠體subfraction上的定位,結(jié)果表明OsTLP27存在

7、于類囊體膜上。酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明OsTLP27錨定在類囊體膜外周(腔側(cè))。
　?、苓^表達(dá)OsTLP27增強(qiáng)水稻光化學(xué)效率并重塑葉綠體結(jié)構(gòu);
　　OsTLP27超表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量并增強(qiáng)其光化學(xué)效率。最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSII量子產(chǎn)額(ΦPSII)、電子傳遞率(ETR)和光化學(xué)淬滅(qP)等都增強(qiáng);過表達(dá)還導(dǎo)致葉綠體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平升高,基粒個(gè)數(shù)增多并且結(jié)構(gòu)變大,光復(fù)合體組成形式也因此發(fā)生了變化;
　

8、?、軴sTLP27間接參與水稻光合作用;
　　OsTLP27的RNA干擾研究表明轉(zhuǎn)基因植株的光合作用受阻,Westernblot結(jié)果表明參與光合作用的蛋白積累受到影響。當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株在含有蔗糖的培養(yǎng)基上生長時(shí)表型無明顯變化,但當(dāng)轉(zhuǎn)移到土壤中生長一段時(shí)間后,植株表型矮小,葉色偏黃。如果OsTLP27的轉(zhuǎn)錄水平低于野生型20%,干擾植株不能在土壤中存活。
　?、轔sTLP27可能具有分子伴侶功能;
　　酵母雙雜交分析表明Os

9、TLP27與核糖體轉(zhuǎn)運(yùn)RNA蛋白RpL31和一個(gè)醛酮氧化還原酶(Aldo-ketooxidoreductase)家族蛋白(AKRFP)相互作用。以O(shè)sTLP27誘餌質(zhì)粒篩選酵母文庫,共篩選到兩個(gè)存在相互作用的蛋白:RpL31和AKRFP蛋白。酵母共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明了OsTLP27蛋白與RpL31和AKRFP蛋白存在相互作用。構(gòu)建熒光雙質(zhì)粒共侵染洋蔥表皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)OsTLP27蛋白與RpL31和AKRFP蛋白確實(shí)是在生物體內(nèi)(inviv

10、o)發(fā)生了相互作用。因此基于互作蛋白分析,我們推測OsTLP27可能作為一個(gè)分子伴侶參與AKRFP的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　這些結(jié)果表明OsTLP27是一個(gè)影響葉綠素體結(jié)構(gòu)和功能的新蛋白。
　　OsDET1保守區(qū)單個(gè)氨基酸改變和其轉(zhuǎn)錄水平的提高導(dǎo)致了水稻高葉綠素含量的表型。但是它的功能獲得型突變(gain-of-function)對突變體生理水平上的影響還需要系統(tǒng)研究。在本文中,我們對突變體的生理生化特性進(jìn)行了研究分析,以下是主要發(fā)