水稻條斑病菌hrp基因簇功能分析及hcm1轉(zhuǎn)基因水稻的研究.pdf

1、水稻條斑病菌（Xanthornonas oryzae pv.oryzicola，Xoc）是水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）種下的兩個致病變種之一，引起的水稻細(xì)菌性條斑?。l斑?。˙acterial Leaf Streak，BLS），近年來成為水稻上的重要病害。水稻條斑病菌同其他革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌一樣擁有hrp基因簇，決定著病原細(xì)菌在非寄主植物上的過敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)和

2、在感病寄主上致病性（pathogenicity）。與水稻互作時，水稻條斑病菌的hrp基因簇編碼形成Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)，將T3SS效應(yīng)蛋白注入植物細(xì)胞中從而導(dǎo)致非寄主產(chǎn)生HR和在水稻上產(chǎn)生細(xì)菌性條斑病癥狀。水稻條斑病菌約27kb的hrp基因簇包括10個hrp，9個hrc（hrp-conserved）和8個hpa（hrp-associated）基因，也稱hrp-hrc-hpa基因簇，并由調(diào)節(jié)因子HrpG和HrpX調(diào)控。雖然水稻條斑病菌

3、的hrp-hrc-hpa基因與其它植物病原黃單胞菌中的hrp-hrc-hpa基因有較高的同源性，但每個基因?qū)Σ≡闹虏⌒院投拘缘呢暙I并不清楚。本研究以野生菌株RS105為出發(fā)菌，利用自殺性載體pKMS1獲得了上述29個hrp基因的無標(biāo)記缺失突變體。植物上接種結(jié)果顯示，hrc基因突變體全部喪失在非寄主上的HR和在水稻上的致病性（H印表型）;hpa基因?qū)rp表型沒有顯著影響，僅hpaB和hpa1基因突變體分別喪失和減弱了在水稻上的致病性

4、;hrp基因中，除hrpF表現(xiàn)為毒性顯著減弱和仍能激發(fā)煙草HR以及hrpE3對Hrp表型沒有改變外，其他hrp基因突變后，病原菌均喪失Hrp表型。這些結(jié)果為進一步揭示hrp-hrc-hpa基因的具體功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了揭示可能的調(diào)控因子對hrp-hrc-hpa基因調(diào)控關(guān)系，本研究根據(jù)其他植物病原黃單胞菌的研究結(jié)果，分別對全局性調(diào)控因子Trh、LrpX、ColR、ColS和Zur在水稻條斑病菌中的基因進行了敲除。水稻上的致

5、病性和煙草上的HR測定結(jié)果顯示，trh、lrpX、 colR、colS和zur突變體降低了水稻條斑病菌在水稻上的毒性，但不影響在煙草上的HR激發(fā)能力。
　　 水稻條斑病菌的hrp基因主要由調(diào)節(jié)因子HrpG和HrpX進行調(diào)控，但至今并不清楚是否HrpG和HrpX調(diào)控所有的hpa-hrp-hrc基因轉(zhuǎn)錄表達。RT-PCR結(jié)果顯示，hrcC、hrpD5、hrpE和hpa3基因的轉(zhuǎn)錄表達不完全依賴HrpG和HrpX的調(diào)控;hrcT受Hr

6、pX調(diào)控不受HrpG調(diào)控，hpa2受HrpG調(diào)控不受HrpX調(diào)控。另外發(fā)現(xiàn)，hrpD6基因突變后，hpa2、hpa1和hpaB基因不轉(zhuǎn)錄表達，hrcC和hrcT基因的轉(zhuǎn)錄表達水平下降。這說明，HrpG和HrpX通過調(diào)控hrpD6的表達而影響了hpa2、hpa1、hrcC、hrcT和hpaB基因的表達。
　　 為了了解其他全局性調(diào)控因子以及HrpG和HrpX對上述基因表達的調(diào)控作用，本研究將hrpA、hrpB、hrpC、hrpD和

7、hpa3轉(zhuǎn)錄單元的啟動子以及hrp基因簇中的啟動子進行了分析，認(rèn)為它們的啟動子分別為phrcC、phrcT1、phrpD51和phpa3。通過軟件分析后還發(fā)現(xiàn)，hrpB轉(zhuǎn)錄單元中的hrcN和hrpD轉(zhuǎn)錄單元的hpaP基因內(nèi)存在可能的啟動子，分別為phrcT2和phrpD52。將上述啟動子分別與gusA基因進行融合，導(dǎo)入野生菌中，在水稻細(xì)胞、hrp誘導(dǎo)培養(yǎng)基XOM3和NB中進行GUS活性測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，phrcC、hrcT1、prhD51

8、和phpa3啟動子可以驅(qū)動gusA基因在水稻細(xì)胞和XOM3中誘導(dǎo)表達，而不能有效在NB中表達。相應(yīng)的，phrcT2和phrpD52在三種條件下都能驅(qū)動gusA基因表達。
　　 為了排除全局性調(diào)控因子對上述基因表達差異的調(diào)控作用，本研究將上述hrp-gusA構(gòu)建以及hrpG和hrpX基因的啟動子分別導(dǎo)入hrpG、hrpX、 trh、lrpX、 colR、colS和zur突變體中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hrpA轉(zhuǎn)錄單元受HrpG、Zur、Col

9、R和Trh的正調(diào)控，不受HrpX、LrpX和ColS的調(diào)控;hrpB轉(zhuǎn)錄單元受HhpX正調(diào)控，不受其他因子的調(diào)控;hrpD轉(zhuǎn)錄單元同時受HrpG和HrpX調(diào)控，不受其他五個全局性調(diào)控因子的調(diào)控;hrpG基因受Trh正調(diào)控，不受其他調(diào)控因子的影響;hrpX基因受HrpG的正調(diào)控影響最大，其次受Zur和ColR的正調(diào)控，但還受LrpX的負(fù)調(diào)控作用。這表明，這些調(diào)控因子通過對hrpG或hrpX基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用而間接的影響hrp基因的轉(zhuǎn)錄表達

10、。而五個全局性調(diào)控因子以及HrpG和HrpX對phrcT2、phrpD52和phpa3沒有調(diào)控作用。這也提示，hrpD5、hrpE和hpa3的調(diào)控受到未知調(diào)控因子的作用。
　　 為了揭示這些因子在轉(zhuǎn)錄后水平上對hrcC、hrpD5、hrpE、hrcT和hpa3的調(diào)控作用，本研究利用Northern雜交對上述調(diào)控因子突變體中的hrcC、hrpD5、hrpE、hrcT和hpa3基因表達進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hrpE基因在hrpX突變

11、體中仍然有低水平的轉(zhuǎn)錄，而在lrpX突變體中表達水平超過野生型。這提示，hrpE基因的表達并不受HrpG、Trh、ColR、ColS和Zur的調(diào)控，但受到HrpX的顯著正調(diào)控作用，并且LrpX對HrpX的負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致hrpE轉(zhuǎn)錄水平升高。遺憾的是，hrcC、hrpD5和hpa3的mRNA水平太低，沒有雜交信號出現(xiàn)。
　　 由于hrpD5、hrpE和hpa3不完全依賴hrpG和HrpX調(diào)控，這促使本研究進一步對其所在的轉(zhuǎn)錄單元構(gòu)成

12、進行分析。對phrpD51和phrpD52進行突變，經(jīng)誘導(dǎo)通過RT-PCR分析后發(fā)現(xiàn)，hrpD轉(zhuǎn)錄單元的啟動子phrpD51突變后，除hrpD5和hrpE基因外，hrcQ、hrcR、hrcS、hpaP、hrpD6、hrpE和hpaB基因不轉(zhuǎn)錄表達，而可能的啟動子對上述基因（hpaP除外）的轉(zhuǎn)錄沒有影響。這說明hrcQ到hpaB基因同處一個轉(zhuǎn)錄單元中，而hrpD5基因的轉(zhuǎn)錄可能受到另外調(diào)控因子的作用。為了證實這個結(jié)果，本為從hrpC轉(zhuǎn)錄單

13、元的hpaP基因開始，以hrpE3基因為終點，以兩兩基因為對象，通過RT-PCR擴增發(fā)現(xiàn)，hrcQ、hrcR、hrcS、hpaA、hrpD5、hrpD6、hrpE和hpaB基因處于同一轉(zhuǎn)錄單元中。這一結(jié)果不同于其它植物病原細(xì)菌黃單胞菌的轉(zhuǎn)錄單元構(gòu)成，但與水稻白葉枯病菌的相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄單元相同。
　　 為了進一步說明HrpD6對hpa2、hpa1、hrcC、hrcT和hpaB基因的調(diào)控作用以及對hrpG和hrpX的轉(zhuǎn)錄表達有影響作用，

14、本研究將hpa2和hpa1的啟動子phpa2和phpa1以及phrcC、phrcT和phrpD51與gusA的融合構(gòu)建，分別置于hrpD6突變體和野生型中，經(jīng)XOM3誘導(dǎo)表達后GUS活性檢測發(fā)現(xiàn)，HrpD6對hpa2、hpa1和hrcC基因以及hrpB轉(zhuǎn)錄單元有正調(diào)控作用，對hrpG、hrpX基因和hrpD轉(zhuǎn)錄單元轉(zhuǎn)錄表達沒有影響。
　　 為了蛋白質(zhì)水平上檢測hrpD6突變后，影響了Hpa2和Hpa1的產(chǎn)生，本研究將hpa1和h

15、pa2基因與c-Myc標(biāo)簽進行融合，分別置于野生菌株、T3S突變體hrcV突變體和hpaB突變體中。蛋白免疫雜交結(jié)果顯示，hrpD6突變體和hpaB突變體中無Hpa2和Hpa1蛋白的分泌。這說明，hpa2、hpa1和hpaB基因在轉(zhuǎn)錄水平上就受到了HrpD6的調(diào)控。為了進一步分析HrpD6對hpaB基因的調(diào)控作用，本研究以HpaB依賴而分泌的效應(yīng)分子AvrXa27和不依賴HpaB而分泌的轉(zhuǎn)位元HrpF為報道基因，分別與FLAG和c-My

16、c進行融合，導(dǎo)入野生菌、T3S突變體hrcV、hrpD6和hpaB突變體中，經(jīng)過相同的誘導(dǎo)，蛋白質(zhì)免疫雜交結(jié)果顯示，hrpD6突變后，與同hpaB突變體一樣，AvrXa27不分泌，HrpF仍能進行分泌。這表明，hrpD6基因突變后，hpaB基因不轉(zhuǎn)錄表達，從而AvrXa27不能進行分泌，而不依賴HpaB的HrpF能夠進行分泌。明確HrpD6是hrp-hrc-hpa基因的調(diào)控因子，在黃單胞菌的hrp基因調(diào)控中還屬首次報道。
　　

17、X.oryzae pv.oryzicola的hpa2基因位于hrp基因簇最左端，啟動子區(qū)域存在imperfect PIP-box，其基因產(chǎn)物屬lytic transglycosylase家族，推測其可能溶解植物細(xì)胞壁從而使T3SS發(fā)揮作用。hrpF基因位于hrp基因簇的右端，在寄主細(xì)胞膜上形成轉(zhuǎn)位裝置將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運至寄主細(xì)胞中。Hpa2和HrpF是否互作，從而決定病原菌的致病性，還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，hpa2和hrpF基因分別突變后，降

18、低了在水稻上的毒性，細(xì)菌生長能力減弱，但不影響在非寄主煙草上的HR。 hpa2和hrpF同時突變后，X.oryzae pv.oryzicola在水稻上喪失了water soaking癥狀和致病性，但在非寄主上仍有HR激發(fā)能力。轉(zhuǎn)錄水平研究發(fā)現(xiàn)，hpa2基因的表達受HrpG調(diào)控，不受HrpX調(diào)控。細(xì)胞定位結(jié)果顯示，Hpa2作用于植物細(xì)胞膜上而非細(xì)胞壁。蛋白質(zhì)互作和免疫雜交結(jié)果顯示，Hpa2通過T3SS進行分泌，并與HrpF互作，控制T3S

19、效應(yīng)分子 AvrXa27轉(zhuǎn)位進入水稻細(xì)胞中，但在hrp誘導(dǎo)培養(yǎng)基上仍等檢測到AvrXa27的分泌，推測Hpa2和HrpF互作形成復(fù)合體，控制效應(yīng)分子轉(zhuǎn)位進入植物細(xì)胞內(nèi)，從而影響病原菌的致病性。
　　 水稻條斑病菌的HrpX能夠調(diào)節(jié)hrp基因的表達，而在被調(diào)節(jié)的因子啟動子區(qū)域一般含有PIP-box(plant-inducible promoter， TTCGC-N15-TTCGC)。為了研究HrpX對hpa1的調(diào)控機制，通過in

20、vivo策略，將啟動子區(qū)域含有PIP-box的hpa1基因啟動子分別與綠色熒光蛋白基因（green fluorescence protein，gfp）進行融合（phpa1::gfp），兩親交配導(dǎo)入水稻條斑病菌野生型菌株和hrpX突變體中，借助水稻懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，觀察啟動子啟動gfp的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在hrpX基因突變體△RhrpX中，融合基因不轉(zhuǎn)錄表達，△RhrpX中菌體不顯示熒光。同時RT-PCR結(jié)果揭示，△RhrpX中hp

21、a1基因不能轉(zhuǎn)錄表達。以上結(jié)果表明，水稻條斑病菌中hpa1的轉(zhuǎn)錄表達受到HrpX的調(diào)控。
　　 水稻條斑病菌的hpa1是唯一已知的編碼Harpin的基因，但是其在引起細(xì)胞死亡的生理生化機制尚不清楚。為此，基于對Hpa1的氨基酸序列分析，本研究將Hpa1缺失互補喪失HR的雙突變體△Rhpa1△hrpF觀察HR，結(jié)果顯示Hpa1 N端的α-helix決定其在非寄主煙草上產(chǎn)生HR，且第47位(C)和第53位(L)氨基酸是關(guān)鍵氨基酸。通

22、過瞬時表達GFP，洋蔥表皮定位顯示Hpa1主要定位于細(xì)胞膜上，暗示其可能通過破壞植物細(xì)胞膜起作用。根據(jù)X.oryzae pv.oryzae中的AvrXa10和Xa10的特異性互作關(guān)系，同時以avrXa10為報道基因，將RS105 hpa1 N端60aa與缺失N端分泌信號(△28aa)的avrXa10融合后導(dǎo)入X.oryzae pv.oryzae PXO99A中，接種含有Xa10的水稻品種IRBB10觀察褐色抗病反應(yīng)，結(jié)果表明Hpa1能經(jīng)

23、細(xì)菌T3S進行分泌，Western Blot泌出性檢測結(jié)果與此一致。這將為進一步揭示非寄主抗性提供更多的理論依據(jù)和有利線索。
　　 鑒于調(diào)控元件PIP-box序列保守性，可以將其作為一個有效的篩選標(biāo)記從大量的基因組數(shù)據(jù)中獲得HrpX調(diào)節(jié)子。基因組信息提示，X.oryzae pv.oryzicola的很多基因在啟動子區(qū)域都含有完整或不完整的PIP-box。因此為了從X.oryzae pv.oryzicola中獲得更多受HrpX調(diào)節(jié)

24、的基因，本研究選取5個候選因子(hrpB1、avrBs2、ecpA、kgtP和Z1234)借助啟動子-gfp（PIP-gfp）融合表達方法，導(dǎo)入X.oryzae pv.oryzicola hrpX基因突變體中，與水稻懸浮細(xì)胞互作后觀察熒光有無或強弱，建立了篩選HrpX調(diào)節(jié)子的體系，同時也提示某些含有imperfect PIP-box的因子如kgtP和Z1234也是HrpX調(diào)節(jié)子，這為新的Ⅲ型效應(yīng)分子的發(fā)掘提供依據(jù)。
　　 鑒于X

25、.oryzae pv.oryzicola hpa1基因編碼產(chǎn)物Harpin具有在非寄主煙草上激發(fā)過敏反應(yīng)的能力，其產(chǎn)物體外施用誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種有益表型，如抗病、抗蟲及促生等，而轉(zhuǎn)基因手段則可以實現(xiàn)其在植物體內(nèi)的運用。為此，將水稻條斑病菌的hpa1放在組成型表達的CaMV35S啟動子下獲得重組質(zhì)粒pBIhpa1。但Hpa1并沒有直接的殺菌活性，為此將Hpa1和Cecropin A(CA)的α螺旋結(jié)構(gòu)以及Melfin(ME)的α螺旋結(jié)構(gòu)通過

26、polylinker以及自由環(huán)進行連接，獲得具有殺菌功能的融合基因hcm1。通過3種不同的構(gòu)建策略將hcm1基因分別放在組成型表達的CaMV35S啟動子、受病原菌誘導(dǎo)表達的hsr203J和PR1a啟動子下獲得重組質(zhì)粒pBIhcm1、pBIhshcm1和pBIPRhcm1。將上述轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌EHA105菌株，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，進行水稻武粳15的成熟胚愈傷組織的轉(zhuǎn)化，獲得hpa1和hcm1轉(zhuǎn)基因水稻植株，能夠激活水稻防