水稻對水稻黑條矮縮病毒的反應(yīng)和抗性轉(zhuǎn)基因水稻培育研究.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟病毒屬（Fijivirus），會引起水稻黑條矮縮和玉米粗縮病，導(dǎo)致在中國、日本、韓國和其他亞洲國家農(nóng)作物產(chǎn)量嚴重損失。感染了水稻黑條矮縮病毒后水稻的主要表現(xiàn)為葉色濃綠，背部葉脈和莖稈上初現(xiàn)蠟白色，后變成褐色的短條瘤狀隆起。水稻黑條矮縮病是由灰飛虱為傳播介體昆蟲的一種病毒病。RBSDV粒子是由直徑大約在75-80納米之間的雙層粒子以及S1到S10的10條雙鏈RNA組

2、成的二十面體結(jié)構(gòu)。
　　盡管人們致力于揭示病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系，但到目前為止，水稻黑條矮縮病的發(fā)病機理仍不清楚。為了明確感染RBSDV后水稻轉(zhuǎn)錄組的改變情況，我們對一個易感水稻品種抗條武育粳3號(KTWYJ3)進行了全轉(zhuǎn)錄組測定。感染了RBSDV的水稻樣本與未感染的健康樣本在典型病害癥狀出現(xiàn)后的兩個時間點取樣（兩個時間點的樣品分別用組Ⅰ和組Ⅱ表示），并進行轉(zhuǎn)錄組比較。第Ⅰ組中感染RBSDV的樣本與健康樣本中有281個顯著差

3、異表達基因(DEGs)，其中102個基因上調(diào)，179個基因下調(diào)。第Ⅱ組中有2592個DEGs，其中1588個基因上調(diào)，1004個基因下調(diào)。兩組中共有的DEGs有66個，這66個DEGs中有36個DEGs的表達模式是相似的。進一步分析表明，在感染RBSDV后一些與疾病防御和抗逆性相關(guān)的基因（如編碼黃酮醇合成酶和水稻細胞壁相關(guān)激酶基因OsWAK32）表達上調(diào)，而與葉綠體相關(guān)的基因（如葉綠素合成酶基因Os0Sg28200.1)表達下調(diào)。此外，

4、一些與株高相關(guān)的基因（例如丙酮酸激酶基因Os11g05110.1)差異表達。該結(jié)果表明這些基因可能參與RBSDV引起的矮化癥狀?？傊?，我們對水稻感染水稻黑條矮縮病毒后全轉(zhuǎn)錄組分析有助于全面了解水稻與RBSDV相互作用以及水稻黑條矮縮病發(fā)病的生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　為了獲得無選擇標記基因的抗黑條矮縮病轉(zhuǎn)基因水稻，我們以編碼水稻黑條矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白P7-2和P8基因S7-2和S8作為RNA干擾(RNAi)的靶標。P7-2是一個F-box蛋

5、白，通過泛素化途徑參與植物和病毒的相互作用，P8是具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的病毒粒子核心蛋白。我們采用含有S7-2或S8基因RNAi結(jié)構(gòu)的雙T-DNA載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得了含有目的基因以及潮霉素抗性選擇標記基因(HPT)的轉(zhuǎn)基因水稻。從這些轉(zhuǎn)基因水稻后代，獲得了無HPT基因的植株。T5代含有S7-2-RNAi或S8-RNAi的純合轉(zhuǎn)基因系在田間自然條件下經(jīng)帶毒灰飛虱的侵染下表現(xiàn)出高抗水稻黑條矮縮病毒。這些結(jié)果表明，通過RNA干擾技術(shù)抑制S

6、7-2或S8基因的表達是一種有效地提高水稻對黑條矮縮病毒抗性的手段。
　　已有實驗結(jié)果表明，病毒侵染植物后通過抑制或激活宿主基因轉(zhuǎn)錄可能會導(dǎo)致明顯的病癥。對水稻黑條矮縮病毒感染早期引起的基因表達變化的了解有助于理解水稻黑條矮縮病發(fā)病機制，并尋找抵抗黑條矮縮病的抗性基因。我們對接種水稻黑條矮縮病毒后三個時間點（3、8和22天）的水稻利用qRT-PCR分析矮縮癥狀相關(guān)基因、防衛(wèi)和脅迫相關(guān)基因、葉綠體和光合作用相關(guān)基因表達隨時間的變化情

7、況。研究結(jié)果表明，一些抗病相關(guān)基因和細胞壁發(fā)育相關(guān)的基因，如纖維素合成(CESA)基因表達發(fā)生改變，其中CESA1和CESA7基因的表達下調(diào)，這可能是造成植株矮化的原因之一。因此，引起矮縮癥狀的原因除株高相關(guān)基因表達發(fā)生變化外，可能細胞壁結(jié)構(gòu)和生物合成相關(guān)基因表達的變化也具一定的作用。與對照比較，我們發(fā)現(xiàn)丙酮酸激酶基因在接種后3天表達顯下調(diào)。OsWRKY基因的表達也發(fā)生顯著變化，例如，OsWRKY78基因的表達在接種后3天顯著升高，但在

8、第8天顯著降低，到第22天又顯著上調(diào)。另一方面，一些葉綠體和光合作用相關(guān)基因在病毒感染早期表達顯著降低，其中葉綠體相關(guān)基因的結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致。
　　小RNA(microRNA，miRNA)在發(fā)育、非生物脅迫和對病原體的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。植物小RNA參與病毒感染，這些病毒應(yīng)答的小RNA與其靶基因和病毒致病性有關(guān)。已有研究結(jié)果在水稻不同組織中鑒定一些參與RBSDV感染的小RNA，這些小RNA和其靶基因在水稻受到RBSDV

9、感染后表達量發(fā)生變化。我們過表達RBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P7-1和P9-1，即P7-1OvE和P9-1OvE，其目的在于探討P7-1和P9-1對水稻RBSDV應(yīng)答的小RNA和其靶基因表達的影響。結(jié)果顯示在T3代轉(zhuǎn)基因水稻中因過表達P7-1和P9-1，一些病毒應(yīng)答小RNA靶基因表達發(fā)生改變。如在過表達P7-1株系中，miR159和miR169靶基因Os01g59660和Os03g48970顯著上調(diào);在過表達P9-1株系中，miR166靶基因O

10、s03g01890和Os10g33960顯著上調(diào);其中，最顯著變化的是在過表達P7-1株系中miR171靶基因Os02g44370表達量的變化，上調(diào)超過3倍，其編碼scarecrow-like轉(zhuǎn)錄因子。水稻黑條矮縮病毒應(yīng)答小RNA靶基因表達量的變化表明這些小RNA表達的變化可能會干擾其對不同發(fā)育過程的調(diào)節(jié)作用?？傊?，我們的研究從另一個方面表明非結(jié)構(gòu)蛋白P7-1和P9-1在水稻黑條矮縮病的發(fā)展過程中的重要作用，其參與了病毒與宿主的互作過程